Summary

Интеграция свободной деривации индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток с использованием матрицы Laminin 521

Published: July 07, 2017
doi:

Summary

Надежный вывод клеток, индуцированных человеком, с плюрипотентными стволовыми клетками (hiPS), был достигнут за счет использования неинтегрирующего вектора передачи вируса Сендай (SeV), опосредованного перепрограммированием дермальных фибробластов. Поддержание клеток hiPS и расширение клона было выполнено с использованием безсеносных и химически определенных условий культивирования с рекомбинантной матрицей ламинана человека 521 (LN-521) и средой Essential E8 (E8).

Abstract

Ксено-свободные и полностью определенные условия являются ключевыми параметрами для надежной и воспроизводимой генерации однородных человеческих клеток с плюрипотентными стволовыми клетками (hiPS). Обслуживание клеток hiPS на фидерных клетках или неопределенных матрицах восприимчиво к периодическим отклонениям, патогенному загрязнению и риску иммуногенности. Использование определенной рекомбинантной матрицы человеческого laminin 521 (LN-521) в сочетании с безсеноновыми и определенными рецептурами среды снижает вариабельность и позволяет обеспечить последовательную генерацию клеток hiPS. Вектор вируса Сендай (SeV) представляет собой неинтегрирующую систему на основе РНК, поэтому можно обойти проблемы, связанные с потенциальным разрушительным эффектом на интеграционные векторы целостности генома. Кроме того, эти векторы продемонстрировали относительно высокую эффективность в перепрограммировании дермальных фибробластов. Кроме того, ферментативный односегментный пассаж клеток облегчает гомогенное поддержание клеток hiPS без существенного предшествующего опыта стволовых клетокКультуру. Здесь мы описываем протокол, который был широко протестирован и разработан с акцентом на воспроизводимость и простоту использования, обеспечивая надежный и практичный способ создания определенных и безсеносных человеческих hiPS-клеток из фибробластов.

Introduction

Поскольку первый вывод клеточных линий hiPS по Takahashi et al. 1 , 2 , hiPS-клетки предоставили полезный инструмент для моделирования болезней, обнаружения лекарств и в качестве исходного материала для создания клеточной терапии в регенеративной медицине. 3 . Культура клеток hiPS уже давно зависит от совместной культивирования с фибробластовыми фидерными клетками 4 , 5 или Matrigel 6 и со средними препаратами, содержащими фетальную бычью сыворотку (FBS). Отклонения от партии к партии являются общим следствием неопределенного характера этих условий культуры, что приводит к непредсказуемым изменениям, что является основным фактором ненадежности этих протоколов 7 . Разработка определенной среды, такой как Essential 8 (E8) 8 и определенные матрицы клеточной культуры, например LN-521 9 , позволяютS для установления высоковоспроизводимых протоколов и помощи в надежной генерации и поддержании гомогенных клеток hiPS 7 , 8 , 9 , 10 .

Развитие методов бесплатного перепрограммирования интеграции было скачком вперед. Первоначально перепрограммирование зависело от ретровирусных векторов, которые случайным образом интегрировались в геном с разрушительным воздействием на геномную целостность 11 . Достижения в методологиях перепрограммирования включают разработку векторов на основе РНК. РНК-векторы имеют преимущество перед методом репрограммирования на основе ДНК, поскольку непреднамеренная интеграция через геномную рекомбинацию невозможна 12 . SEV-векторы обеспечивают высокую и временную экспрессию экзогенных факторов посредством одноцепочечной РНК без ДНК-фазы 11 . Перепрограммирующие векторы, поставляемые SeVРазводят по всему клеточному расширению и, в конце концов, избавляются от культуры, обеспечивая свободный способ перепрограммирования. После этого поддержание плюрипотентности зависит от эндогенной экспрессии плюрипотентных генов 2 .

Поскольку новаторские методы терапии на основе hiPS начинают переходить в клинические испытания, требования к стандартизованным партиям, воспроизводимости и безопасности являются важными проблемами для решения проблемы 13 . Поэтому следует избегать продуктов животного происхождения. Например, использование ксеногенных продуктов связано с риском заражения нечеловеческим патогеном. Было показано, что клетки, культивируемые в присутствии компонентов культуры животного происхождения, включают в себя нечеловеческие силикатные кислоты в клеточные мембраны, которые угрожают сделать производные клетки иммуногенными 14 . Следовательно, необходимость устранения ксеногенных продуктов необходима для любых будущих клинических занятий. Этот протокол применяется xeБесплодная и определенная культура в поддержании клеток hiPS, перемещающих клетки ближе к клиническому соблюдению.

Этот протокол описывает последовательный, очень воспроизводимый и простой в использовании метод, который генерирует стандартизованные клетки hiPS из фибробластов. Он также предлагает удобную систему культивирования для обслуживания установленных hiPS-камер. Этот протокол был использован для получения более 300 линий клеточных линий hiPS на шведском национальном объекте iPS Core человека в Каролинском институте, из которых некоторые линии ранее были описаны 15 , 16 .

Protocol

Сбор материала пациента и вывод клеток hiPS утверждается Советом по обзору этики, Стокгольм, 28 марта 2012 года, Регистрационный номер: 2012 / 208-31 / 3. Этапы клеточной культуры должны выполняться в шкафах биобезопасности, если не указано иное. При работе с клетками всегда применяйте методы стери…

Representative Results

От биопсии до клеток hiPS Весь процесс от биопсии к установленным клеткам hiPS, свободный от вектора перепрограммирования и готовый к характеристике, занимает приблизительно 16 недель ( рис. 1 ). Более подробная временная шкал…

Discussion

Ожидаемым результатом этого протокола является успешное создание нескольких клонированных клеточных линий hiPS. Важно отметить, что способ поддержания и расширения установленных hiPS-клеток, описанный здесь, является надежным и может быть осуществлен с небольшим предварительным опытом…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана финансирующими агентами SSF (B13-0074) и VINNOVA (2016-04134).

Materials

Dispase Life Technologies 171105-041 Biopsy digestion
Collagenase Sigma C0130 Biopsy digestion
Gelatin Sigma G1393 Fibroblast matrix
IMDM Life Technologies 21980002-032 Fibroblast medium
FBS Invitrogen 10270106 Fibroblast medium
PenicillinStreptomycin Life Technologies 15070-063 Antibiotic
Essential 8 media ThermFisher Scientific A1517001 iPS cell culture media
LN-521 Biolamina LN521-03 iPS cell culture matrix
TrypLE select 1X ThermoFisher Scientific 12563011 Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632 Millipore SCM075 Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit Life Technologies A1377801 Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dish Sarstedt 83.3900.300 Cell culture
60 mm tissue culture dishes Sarstedt 83.3901.300 Cell culture
24 well tissue culture plates Sarstedt 83.3922.300 Cell culture
T25 tissue culture flasks VWR 734-2311 Cell culture
15 ml tubes Corning 430791 Centrifuge tubes
1.5 ml tube Eppendorf 0030123.301 1.5 ml tube
CoolCell cell LX Biocision BCS-405 Freezing container
DMSO Sigma D2650-100ml Fibroblast freezing
Cryovials 1.8 ml VWR 479-6847 Cryovials
PSC Cryopreservation Kit Gibco A2644601 PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisherScientific 25300054 Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12 Life Technologies 31331-028 Digestive enzymes dilutant
DPBS Life Technologies 14190-094 PBS
HBSS ThermoFIsher Scientific 14025-050 Biopsy preparation
Haemocytometer Sigma BRAND, 718920 Cell counting

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).
  3. Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).
  4. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  5. Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).
  6. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  7. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).
  8. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).
  9. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  10. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
  11. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  12. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  13. Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).
  14. Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).
  15. Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).
  16. Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
  17. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009)
  18. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
  19. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
  20. Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).
  21. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).
  22. . Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016)
  23. Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).

Play Video

Citer Cet Article
Uhlin, E., Marin Navarro, A., Rönnholm, H., Day, K., Kele, M., Falk, A. Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix. J. Vis. Exp. (125), e56146, doi:10.3791/56146 (2017).

View Video