Summary

Een gemodificeerd Yeast-One Hybrid System voor Heteromere Proteïne Complex-DNA Interactie Studies

Published: July 24, 2017
doi:

Summary

De gemodificeerde gist-een-hybride analyse die hier wordt beschreven is een uitbreiding van de klassieke gist-hybride (Y1H) -assay om de heteromeer eiwitcomplex-DNA-interactie te onderzoeken en valideren in een heterologe systeem voor elke functionele genomica-studie.

Abstract

In de loop der jaren is de gist-hybride test een belangrijke techniek voor de identificatie en validatie van fysieke interacties tussen eiwitten zoals transcriptiefactoren (TF's) en hun DNA-doelwit. De hier geplaatste methode maakt gebruik van het onderliggende concept van de Y1H, maar wordt verder gemodificeerd om eiwitcomplexen te binden en te valideren die binden aan hun doel DNA. Derhalve wordt het aangeduid als de gemodificeerde gist-een-hybride (Y1.5H) -assay. Deze analyse is kosteneffectief en kan gemakkelijk uitgevoerd worden in een reguliere laboratoriuminstelling. Alhoewel het gebruik van een heterologe systeem, zou de beschreven methode een waardevol instrument kunnen zijn om het heteromeer eiwitcomplex te binden aan hun DNA-doelwit (en) voor functionele genomica in elk systeem van studie, met name plantgenetica, te testen en te valideren.

Introduction

In het algemeen, om eiwit-DNA-interacties te begrijpen, is de Y1H-analyse het voorkeurssysteem dat succesvol is gebruikt in een laboratoriuminstelling 1 . De basis Y1H analyse omvat twee componenten: a) een reporterconstruct met DNA van belang die succesvol is gekloneerd stroomopwaarts van een gen dat codeert voor een reporter eiwit; En b) een expressieconstruct dat een fusie-eiwit tussen de TF van belang en een gist transcriptie activatie domein (AD) zal genereren. Het DNA van belang wordt vaak aangeduid als 'aas', terwijl het fusie-eiwit bekend staat als 'prooi'. In de afgelopen jaren zijn meerdere versies van de Y1H-test ontwikkeld om aan specifieke behoeften te voldoen met hun eigen voordelen 2 . De bestaande Y1H-analyse kan succesvol worden geïmplementeerd om de interactie van één eiwit tegelijkertijd te identificeren en te valideren met zijn DNA-aas, maar ontbreekt aan de mogelijkheid om heterodimere of multimere eiwit-DNA-interacties te identificeren.

"> De hier beschreven methode is een gewijzigde versie van de bestaande Y1H waardoor onderzoekers gelijktijdig meerdere eiwitten kunnen binden die binden aan hun doel DNA-sequentie (en). Het doel van deze analyse is om het eiwit van belang uit te drukken met een activatie domein (pDEST22: TF) en de activatie van de kandidaat-DNA-regio's die gefuseerd zijn aan een verslaggever in de aanwezigheid en / of afwezigheid van de interactieve eiwitpartner (pDEST32ΔDBD-TF) in het gistsysteem beoordelen. Deze analyse zal ons toelaten om te bepalen of de interactie tussen deze twee Eiwitten zijn nodig voor het activeren van het doel. Dit is een GATEWAY-kloningsysteem en is daarom uitvoerbaar in een reguliere laboratoriumomgeving. Dit protocol is gebaseerd op directe transformatie, die het gemak van de co-transformatie van verschillende TF's in een gistsysteem mogelijk maakt . Zo is het een voordelige strategie om de eiwitcomplexen te binden die binden aan hun mogelijke DNA-doelen voor in vitro moleculaire en functionele validatie fOf elk systeem. Huidige technieken zoals Tandem affiniteitszuivering (TAP) methoden zijn kostbaar en arbeidsintensief, maar laten opsporen van proteïen heterrocomplexen op grote schaal 3 , 4 , 5 . Deze gemodificeerde gist-hybride kan met succes op een kleine schaal worden uitgevoerd ( Figuur 1 ) en is ook kosteneffectief. De Y1.5H-analyse kan onderzoekers over de gehele gemeenschap vergemakkelijken om hun hypothese te testen en te valideren om de rol van multimere eiwitcomplex te binden aan een gemeenschappelijk DNA-doelwit met behulp van een heterologe systeem. Op grond van de bevindingen kan de hypothese in vivo in het voorkeursonderzoek worden gevalideerd. Onlangs hebben we deze benadering gebruikt om de rol van een TF en zijn wijze van actie te bepalen om bloei in Arabidopsis 6 te regelen.

Protocol

1. Construeren en Reporter Plasmide Bereiding PCR amplificeert de promotorregio's / "fragmenten" (bij voorkeur ~ 250-500 bp) van het doel DNA dat geanalyseerd moet worden voor verdere kloning in de invoervector onder toepassing van E. coli (TOP10). Bij sequentiebepaling, subcloneer de positieve kloon in een compatibele pGLacZi expressievector 7 zoals eerder beschreven 8 , 9 , <s…

Representative Results

De algemene plaatopzetprocedure voor de co-transformatie van DNA-gebieden in de gistcellen met eiwit van belang ( Figuur 2 ). De plaatopstelling kan worden gewijzigd volgens de behoefte van het experiment en het aantal geteste DNA-gebieden / fragmenten. Na dag 5 van het protocol moet een goed gegroeide en positieve plaat zichtbaar zijn zoals in figuur 3 . In onze studie werd het promotorgebied van 2600 bp stroomopwaarts vanaf he…

Discussion

De bestaande Y1H standaardprocedure is geschikt voor het identificeren van een enkelvoudige eiwitbietbinding aan het DNA-aas. Met diverse technische wijzigingen is het bestaande systeem aangewend voor het definiëren van transcriptie regulerende netwerken. TF's zijn echter bekend als een onderdeel van complexen die twee of meer TF's of eiwitten omvatten, waarbij slechts enkele van de TF in staat zijn om aan het DNA te binden. Proteïnen of TF's die alleen de eiwitbindende domeinen bezitten en het vermogen he…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We bedanken SS Wang, M. Amar en A. Galla voor het kritisch lezen van het manuscript. Onderzoek dat in deze publicatie is gerapporteerd, werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Algemene Medische Wetenschappen van de National Institutes of Health onder onderscheidingsnummers RO1GM067837 en RO1GM056006 (naar SAK). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Materials

pDEST22 vector Invitrogen PQ1000101 Pro-Quest Two hybrid system kit
pDEST32delatDBD Invitrogen PQ1000102 Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain
pENTR/D-TOPO Cloning Kit Invitrogen K240020
YM4271 Strain Clontech K1603-1 MATCHMAKER One-Hybrid System
pEXP-AD502 Invitrogen PQ1000101 Pro-Quest Two hybrid system kit
GATEWAY LR Clonase II enzyme mix Invitrogen 11791020
YPDA media Clontech 630410
SD-Agar Clontech 630412
SD minimal media Clontech 630411
Uracil DO Supplement Clontech 630416
Tryptophan Do Supplement Clontech 630413
Tris Base Fisher Scientific BP152-1
EDTA Fisher Scientific S311-500
LiAc Sigma-Aldrich L4158
Saplmon Sperm (10mg/ml) Invitrogen 15632011
96 well round bottom Plate Greiner bio-one 650101
PEG3350 Sigma-Aldrich 1546547
96-deep well block USA Scientific 1896-2000
Sealable Foil USA Scientific 2923-0110
Araseal Excel Scientific B-100
2-mercaptoethanol Fisher Scientific 034461-100
ONPG Sigma-Aldrich 73660
Na2CO3 Sigma-Aldrich 223484
Na2HPO4  Sigma-Aldrich S3264
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S3139
KCL Fisher Scientific BP366-500
MgSO4  Sigma-Aldrich 83266
HCL Fisher Scientific SA54-4
Drybath Thermo Fischer
Voretx Thermo Fischer
Centrifgue Eppendorf Centrifuge 5810R
Plate Reader Molecular Device SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer
Incubator Thermo Fisher Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees
Shaker Incubator New Brunswick
Water Bath Thermo Fisher IsoTemp 205
Puncher
50 ml Falocn BD Falcon
Beaker Nalgene
Flask Nalgene
Petriplates (150mm) Greiner bio-one

References

  1. Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
  2. Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
  3. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  4. Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  5. Gavin, A. -. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
  6. Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
  7. Helfer, A., et al. LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).
  8. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
  9. Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
  10. Klein, P., Dietz, K. -. J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
  11. Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome. Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).
  12. Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens. CSH Protoc. 2006 (5), (2006).
  13. Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. A gateway-compatible yeast one-hybrid system. Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).

Play Video

Citer Cet Article
Tripathi, P., Pruneda-Paz, J. L., Kay, S. A. A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies. J. Vis. Exp. (125), e56080, doi:10.3791/56080 (2017).

View Video