用于异构蛋白复合物 - DNA相互作用研究的修饰的酵母一杂交系统
Summary
这里描述的修饰的酵母单杂交测定法是经典酵母单杂交（Y1H）测定法的扩展，以研究和验证异源蛋白复合物 – DNA异构体系中任何功能基因组学研究的相互作用。
Abstract
多年来，酵母单杂交测定已被证明是识别和验证蛋白质（如转录因子（TF））及其DNA靶标之间的物理相互作用的重要技术。本文提出的方法利用Y1H的基本概念，但进一步修改以研究和验证与其靶DNA结合的蛋白质复合物。因此，其被称为修饰的酵母单杂交（Y1.5H）测定。该测定是成本有效的，并且可以在常规实验室设置中容易地进行。 尽管使用异源系统，但是所描述的方法可能是用于在任何研究系统，特别是植物基因组学中测试和验证异源蛋白复合物与其用于功能基因组学的DNA靶标结合的有价值的工具。
Introduction
一般地，为了了解蛋白质-DNA相互作用，所述Y1H测定是在实验室设置1成功地使用的优选系统。基本的Y1H测定涉及两个组分：a）在编码报道蛋白的基因上游成功克隆了目标DNA的报道构建体;和b）将在感兴趣的TF和酵母转录激活结构域（AD）之间产生融合蛋白的表达构建体。感兴趣的DNA通常被称为“诱饵”，而融合蛋白被称为“猎物”。在过去几年中，已经开发了多种版本的Y1H测定法，以适应具体需求，具有自己的优点2 。可以成功实施现有的Y1H测定，以一次鉴定和验证一种蛋白质与其DNA诱饵的相互作用，但缺乏识别异二聚体或多聚体蛋白质 – DNA相互作用的能力。
“>这里描述的方法是现有Y1H的修改版本，使研究人员能够同时研究与其靶DNA序列结合的多种蛋白质，该测定的目的是用激活结构域表达感兴趣的蛋白质（pDEST22： TF），并在酵母系统中存在和/或不存在相互作用的蛋白质配偶体（pDEST32ΔDBD-TF）的情况下评估与报告子融合的候选DNA区域的活化，该测定将允许我们确定这两个蛋白质是激活靶标所必需的，这是一种GATEWAY克隆兼容系统，因此可用于常规实验室设置，该方案基于直接转化，提供了酵母系统中不同TFs的共转化因此，验证蛋白质复合物与其可能的DNA靶标结合的体外分子和功能验证是一个有利的策略或任何系统。如串联亲和纯化（TAP）的方法目前的技术是昂贵的和劳动密集的，但允许大规模3，4，5蛋白hetrocomplexes的检测。这种修饰的酵母单杂交体可以在小规模的常规实验室设置中成功进行（ 图1 ），并且也具有成本效益。 Y1.5H测定可以促进社区的研究人员测试和验证他们的假设，以使用异源系统定义多聚体蛋白复合物与常见DNA靶标的作用。根据研究结果，该假设可以在优选的研究系统中在体内得到验证。最近，我们采用这种方法来定义TF的作用及其作用方式来调节拟南芥6的开花。Protocol
1.构建和记录质粒制备 PCR扩增待分析的靶DNA的启动子区/“片段”（优选约250-500bp），以使用大肠杆菌 （TOP10）进一步克隆入入载体。 一旦测序确认，亚克隆阳性克隆在7如前所述8，9，10，11兼容pGLacZi表达载体。 通过pGLacZi的同源重组变换启动子融合?…
Representative Results
用于共同转化酵母细胞中DNA区域与感兴趣蛋白质的一般平板安装程序（ 图2 ）。可以根据实验的需要和测试的DNA区域/片段的数量来修改平板设置。在方案的第5天之后， 如图3所示，可以看到良好生长和阳性的平板。在我们的研究中，从转录起始位点开始上游的2600bp的启动子区被分成6个区域或片段（FR 1-6） 6 ?…
Discussion
现有的Y1H标准方法适用于鉴定与其DNA诱饵结合的单一蛋白质猎物。通过各种技术修改，现有系统已被用于定义转录调控网络。然而，TF已知作为涉及两种或更多种TF或蛋白质的复合物的一部分，只有一些TF能够结合DNA。仅具有蛋白质结合结构域并且缺乏与DNA结合能力的蛋白质或TF更可能在复合物中起作用，优选使用能够结合DNA的TF。使用传统Y1H的高通量屏幕偶尔会忽略这些生物重要的相互作用。因此…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢SS Wang，Amar和A. Galla对手稿的批判性阅读。本出版物报道的研究得到了美国国家卫生研究院综合医学科学研究所的支持，获得了授权号RO1GM067837和RO1GM056006（SAK）。内容完全是作者的责任，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。
Materials
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Strain | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER One-Hybrid System |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| GATEWAY LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD minimal media | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Supplement | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Supplement | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 well round bottom Plate | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-deep well block | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Sealable Foil | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Plate Reader | Molecular Device | SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer | |
| Incubator | Thermo Fisher | Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees | |
| Shaker Incubator | New Brunswick | ||
| Water Bath | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask | Nalgene | ||
| Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
References
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Citer Cet Article
Tripathi, P., Pruneda-Paz, J. L., Kay, S. A. A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies. J. Vis. Exp. (125), e56080, doi:10.3791/56080 (2017).