A الخميرة تعديل واحد نظام هجين ل هيتيروميريك البروتين مجمع دنا التفاعل الدراسات
Summary
الخميرة المعدلة اختبار واحد الهجين وصفها هنا هو امتداد الخميرة الكلاسيكية واحد الهجين (Y1H) فحص لدراسة والتحقق من صحة البروتين هيتيروميريك معقدة التفاعل الحمض النووي في نظام غير متجانسة لأي دراسة الجينوم وظيفية.
Abstract
على مر السنين، وقد أثبتت الخميرة اختبار واحد الهجين لتكون تقنية هامة لتحديد والتحقق من التفاعلات المادية بين البروتينات مثل عوامل النسخ (تفس) وهدف الحمض النووي. الطريقة المعروضة هنا تستخدم المفهوم الأساسي لل Y1H ولكن يتم تعديلها كذلك لدراسة والتحقق من صحة المجمعات البروتين ملزمة للحمض النووي المستهدف. وبالتالي، فإنه يشار إلى الخميرة المعدلة واحد الهجين (Y1.5H) فحص. هذا الفحص هو فعالة من حيث التكلفة ويمكن تنفيذها بسهولة في إعداد المختبر العادية. على الرغم من استخدام نظام غير متجانسة، يمكن أن تكون الطريقة الموصوفة أداة قيمة لاختبار والتحقق من صحة بروتين هتيروميريك مجمع ملزم لهدفها (ق) الحمض النووي لعلم الجينوم وظيفية في أي نظام للدراسة، وخاصة الجينوم النبات.
Introduction
بشكل عام، لفهم التفاعلات البروتين الحمض النووي، وفحص Y1H هو النظام المفضل تستخدم بنجاح في إعداد مختبر 1 . يتضمن مقايسة Y1H الأساسية عنصرين: أ) بناء مراسل مع الحمض النووي من الفائدة المستنسخة بنجاح المنبع من الجينات ترميز بروتين مراسل. و ب) بناء التعبير الذي سيولد البروتين الانصهار بين تف الفائدة ومجال تنشيط النسخ الخميرة (أد). ويشار إلى الحمض النووي من الفائدة عادة باسم "الطعم" في حين أن البروتين الانصهار المعروف باسم "فريسة". في السنوات الماضية، وقد وضعت إصدارات متعددة من مقايسة Y1H لتناسب احتياجات محددة مع مزاياها الخاصة 2 . ويمكن تنفيذ مقايسة Y1H الحالية بنجاح لتحديد والتحقق من صحة التفاعل من بروتين واحد في وقت واحد مع الطعم الحمض النووي، ولكن يفتقر إلى القدرة على تحديد هيتيروديمريك أو مولتيمريك التفاعلات الحمض النووي البروتين.
"> الطريقة الموصوفة هنا هي نسخة معدلة من Y1H القائمة تمكن الباحثين من دراسة البروتينات المتعددة في الوقت نفسه ملزمة لتسلسل الحمض النووي المستهدف لها.والهدف من هذا الفحص هو التعبير عن البروتين من الاهتمام مع مجال التنشيط (pDEST22: تف) وتقييم تفعيل مناطق الحمض النووي المرشح تنصهر لمراسل في وجود و / أو عدم وجود شريك البروتين التفاعل (pDEST32ΔDBD-تف) في نظام الخميرة، وهذا الفحص يسمح لنا لتحديد ما إذا كان التفاعل بين هذين هناك حاجة إلى البروتينات لتنشيط الهدف.هذا هو نظام متوافق الاستنساخ غيتيواي، وبالتالي من الممكن استخدامها في إعداد المختبر العادية.وتستند هذه ثروبوتروكول على التحول المباشر، والذي يوفر سهولة التحول المشترك لمختلف تفس في نظام الخميرة ، وبالتالي، فإنه هو استراتيجية مفيدة للتحقق من صحة المجمعات البروتين ملزمة لأهداف الحمض النووي المحتملة لفي المختبر الجزيئية والتحقق وظيفية وأو أي نظام. التقنيات الحالية مثل طرق تقارب جنبا إلى جنب (تاب) أساليب مكلفة والعمل كثيفة ولكن تسمح الكشف عن البروتين هيتروكومبلكسس على نطاق واسع 3 ، 4 ، 5 . هذا الخميرة المعدلة واحد الهجين يمكن أن يؤديها بنجاح في إعداد مختبر منتظم على نطاق صغير ( الشكل 1 ) وأيضا فعالة من حيث التكلفة. يمكن لفحص Y1.5H تسهيل الباحثين في جميع أنحاء المجتمع لاختبار والتحقق من صحة فرضيتهم نحو تحديد دور البروتين مولتيمريك معقدة ملزمة هدف الحمض النووي المشترك باستخدام نظام غير متجانسة. واستنادا إلى النتائج، يمكن التحقق من صحة الفرضية في الجسم الحي في النظام المفضل للدراسة. في الآونة الأخيرة، استخدمنا هذا النهج لتحديد دور تف وطريقة عملها لتنظيم المزهرة في أرابيدوبسيس 6 .Protocol
Representative Results
Discussion
الإجراء القياسي Y1H الحالي هو مناسبة لتحديد فريسة واحدة من البروتين فريسة ملزمة لطعم الحمض النووي. مع التعديلات الفنية المختلفة، تم تسخير النظام الحالي لتحديد الشبكات التنظيمية النسخي. ومع ذلك، من المعروف أن تفس تعمل كجزء من المجمعات التي تنطوي على اثنين أو أكثر من ت?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر سس وانغ، M. عمار و A. غالا على قراءة نقدية للمخطوطة. تم دعم البحوث الواردة في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة في المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة RO1GM067837 و RO1GM056006 (إلى ساك). المحتوى هو فقط من مسؤولية المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Strain | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER One-Hybrid System |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| GATEWAY LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD minimal media | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Supplement | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Supplement | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 well round bottom Plate | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-deep well block | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Sealable Foil | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Plate Reader | Molecular Device | SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer | |
| Incubator | Thermo Fisher | Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees | |
| Shaker Incubator | New Brunswick | ||
| Water Bath | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask | Nalgene | ||
| Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
References
- Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
- Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Gavin, A. -. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
- Helfer, A., et al. LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).
- Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
- Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
- Klein, P., Dietz, K. -. J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
- Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome. Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).
- Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens. CSH Protoc. 2006 (5), (2006).
- Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. A gateway-compatible yeast one-hybrid system. Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).
