Summary

메서드 및 Adeno 관련 바이러스를 쥐의 정 맥 관리 및 중앙 신경 전달의 평가 대 한 팁

Published: August 25, 2017
doi:

Summary

쥐에서 대규모 중앙 신경 유전자 배달 방법 적용 됩니다. 이 예제에서는 목적은 전체 척수에 영향을 미치는 질병을 모방 이다. 광범위 한 변환, 주변 관리에서 CNS에 치료 단백질을 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다.

Abstract

정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR), optogenetics, cre lox 타겟팅, 등 클러스터 Adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터는 신경 과학에 키 시는. 이 원고의 목적은 AAV의 꼬리 정 맥 주입을 통해 쥐에 광대 한 중앙 신경 시스템 (CNS) 유전자 전송을 시도 하는 탐정을 원조 하기 위하여. 대규모 식 광범위 한 병 리, 조건에 대 한 관련 이며 쥐 모델은 중요 한 그것의 큰 크기와 쥐에 비해 인 간에 게 생리 적인 유사성 때문입니다. 이 예제에서는 응용 프로그램에서 대규모 신경 전달 전체 척수, 루 경화 증 (ALS)에 영향을 미치는 신경 질환을 모방 하는 데 사용 됩니다. 효율적인 대규모 CNS 변환 전 임상 연구에서 치료 단백질 요소를 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다. 몇 주 후 주입 식 간격 후 변환의 효과 평가 됩니다. 녹색 형광 단백질 (GFP) 제어 벡터에 대 한 소 뇌에 GFP 양의 기본적인 이미징 프로그램에 의해 신속 하 고 안정적으로 추정 된다. ALS에 의해 유도 모터 질병 고기 관련 단백질 양자가 응답 43 kDa (TDP-43)의 DNA 묶는 단백질, 적자 탈출 반사와 rotarod에 의해 득점 된다. 질병 모델링 및 유전자 치료, 대규모 진 여기에 설명 된 대상에 대 한 다양 한 잠재적인 신청이 있다. 이 메서드를 사용 하 여 확장 된 가설 신경 과학에서 neurogenetics 테스트를 신속에 도움이 됩니다.

Introduction

왜냐하면 그들은 너무 신경 vivo에서 시험에 대 한 효율적인 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터 CNS 연구를 위한 필수적인 도구는. AAV 벡터는 매우 다른 transgenes 및 단백질 isoforms, 다른 조직, 다른 호스트 종, 그리고 관리의 다른 노선 공부에 대 한 다양 한. 예를 들어, AAV 관리할 수 마우스 주변 기기로, 상대적으로 비-침략 적, 처음으로 신경 통해 CNS transduce를 정 맥 주사 설명 Foust 에 두 끼 외. Gombash 그 외 여러분 에 의해 (참조 정돈 종이 (2014))입니다. 1 , 2 , 3 이 유전자 납품 방법은 어느 녹색 형광 단백질 (GFP)를 효율적으로 표현 하 쥐에 사용 됩니다 또는 ALS 관련 단백질, 양자가 응답 CNS에서 43 kDa (TDP-43)의 DNA 묶는 단백질. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 중요 한는 쥐에서 일 쥐의 생리 및 대사 매개 변수는 마우스에 비해 인 간에 게 가까이 있으며 행동 및 독물학 분석 실험 쥐를 위해 특별히 설계 된 때문입니다. 또한, 더 많은 유전자 변형 쥐 라인 제공 되고있다는 AAV 유전자 전달 연구에 이용 될 수 있다.

메서드는 쥐, 그리고 결과의 신속 하 고 신뢰할 수 있는 정량화에 광대 한 CNS 유전자 이동에 대 한 자세한. 대규모 CNS 변환 척수 전체 TDP-43으로 표현 하 여 쥐에서 ALS의 징후를 모방 하는 데 사용 됩니다. 방법은 TDP-43 벡터 잭슨 에 사용으로 젊은 성인 쥐의 꼬리 정 맥 주사 6 , 8 , 9 몇 주 후, TDP-43-유도 모터 적자는 승리 두 가지 방법으로: 반사와 데이 턴 에 잭슨 그 외 여러분 사용 rotarod 탈출 5 , 6 , 7 , 9 사후 분석, 제어 GFP 벡터에 대 한 소 뇌의 형광 영역으로 계산 됩니다 변환 효율 잭슨 에서 사용 되는 인덱스 6 , 8 소 뇌의 분석 주변 유전자 납품 후 CNS 변환의 정도의 신속 하 고 신뢰할 수 있는 색인 것을 입증 했다 고 주변 중앙 유전자 전송을 시도 하는 접근의 다양 한에 적용 해야 합니다.

Protocol

모든 절차에 따라 적절 한 NIH 지침. 모든 절차는 동물 관리 및 사용 위원회 위조에 LSU 건강 과학 센터에 의해 승인 된 동물 프로토콜을 따 랐 다. 여성 Sprague-Dawley 쥐 나이의 6 주에는이 절차에 대 한 사용 되었다. 1. 필요한 벡터의 복용량/볼륨 결정 무게 벡터 준비 titer (농도)를 기반으로 하는 주입 각 동물에 필요한 바이러스 성 벡터의 크기를 결정 하 쥐. 이전 쥐 CNS에?…

Representative Results

TDP-43 유도 모터 장애 AAV TDP-43 사용 (그림 1)의 복용량에 따라 2-6 주 이내에 발생 한다. 실패 한 꼬리 정 맥 주사 될 부분 또는 없음; AAV 효과 생산 하기 위해 혈 류를 도달 해야 합니다. AAV GFP의 성공적인 주입 벡터 복용량 의존 방식으로 뇌와 척수에 걸쳐 GFP 식에서 발생 합니다. 드라이브 식, 세포 치킨 베타 걸 하이브리드 발기인, CAG 발기인 라고도 강?…

Discussion

다양 한 전달 경로 AAV 벡터에 대 한 테스트 되었습니다: 내부 parenchymal 내부-cerebroventricular, 내부 thecal, 정 맥, intranasal, 내부 근육, 등. 각 경로 특정 장점 뿐만 아니라 단점으로 할 수 있습니다. AAV의 성인 쥐의 꼬리 정 맥 행정은 CNS의 일관 된 변환 달성 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법입니다. 주변 주입 방법 CNS 조직으로는 주입 정 맥의 소개를 방지 하 고 최소 침 습 이므로. 이 방법으로 얻을 수 있?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 ALS 협회, Karyopharm 치료제, Inc., Meira GTx, 토마스 Lawson을 우리는 감사에서 ALS 연구에 대 한 자선 기부에 의해 투자 되었다. 우리 감사 Elysse 과수원과도 나 Burney 조언과 훈련. JAS 거짓말 재단이 지원 하 고 건강의 국가 학회 GM103418를 부여 합니다.

Materials

Scale Pelouze SP5
Nalgene bucket Thermo Scientific 12014000 4000 mL
Microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Lactated Ringer's Solution Baxter Healthcare 0338-0114-04
Mini vortexer Fisher Scientific 128101
Centrifuge Eppendorf 22624415
Laboratory film Bemis PM996
1-mL syringe BD 309626 Comes with a 25g needle attached.
Replace with 27-30g needle for injection
30g needle BD 305106
Isoflurane Piramal Healthcare 66794-013-25 Isoflurane USP 250 mL
Anesthesia mask Kopf Instruments 906
Gauze Henry Schein 100-2524 2" x 2" (5cm x 5cm)
Pipet tips USA Scientific 1111-0816
Micropipet Gilson 4642080
Gas anesthesia vaporizer SurgiVet 4214322 Classic T3
Gas anesthesia scavenger SurgiVet 32373B10 Enviro-PURE
Heating pad Sears 17280
Bench pad VWR 56617-006
Rotarod Panlab/Harvard Apparatus 76-0772 4 rats/ 4 mice
70% Ethanol Decon Laboratories, Inc. 2401 140 proof
70% Isopropanol VWR 89108-160
Scion Image Scion Corporation
GFP Tag Polyclonal Antibody Invitrogen A11122 Primary Antibody – 1:500 dilution
AlexaFluor 488 Invitrogen A11070 Secondary Antibody – 1:300 dilution
Axioskop 40 microscope Zeiss

References

  1. Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
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Citer Cet Article
Grames, M. S., Jackson, K. L., Dayton, R. D., Stanford, J. A., Klein, R. L. Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction. J. Vis. Exp. (126), e55994, doi:10.3791/55994 (2017).

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