Métodos y consejos para la administración intravenosa del Virus Adeno-asociado a las ratas y la evaluación de la transducción de señales del sistema nervioso Central
Summary
Se cubren métodos para una entrega de genes de gran escala del sistema nervioso central en la rata. En este ejemplo, el propósito es imitar una enfermedad que afecta a la médula espinal entera. La transducción generalizada se puede utilizar para proporcionar una proteína terapéutica al SNC de una administración periférica, una sola vez.
Abstract
Vectores de virus adeno-asociado (AAV) son un reactivo dominante en las neurociencias agrupadas regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) optogenetics, cre-lox targeting, etcetera. El objetivo de este manuscrito es ayudar al investigador tratar de transferencia de genes de la expansiva del sistema nervioso central (SNC) en la rata mediante inyección en la vena cola de AAV. Expresión de gran escala es relevante para las condiciones con patología extensa, y un modelo de rata es significativo debido a su mayor tamaño y las semejanzas fisiológicas a los seres humanos en comparación con ratones. En esta aplicación de ejemplo, una transducción neuronal de gran escala se utiliza para imitar una enfermedad neurodegenerativa que afecta a la médula espinal entera, esclerosis lateral amiotrófica (ELA). La transducción eficiente de CNS de gran escala también puede utilizarse para proporcionar factores de proteína terapéutica en estudios pre-clínicos. Después de un intervalo de expresión después de la inyección de varias semanas, se evaluaron los efectos de la transducción. Para una proteína fluorescente verde (GFP) control de vectores, la cantidad de GFP en el cerebelo calcula rápidamente y confiablemente por un programa básico de la proyección de imagen. Para fenotipos de enfermedad motor que son inducidos por la ALS respuesta transactive proteína DNA-proteína de 43 kDa (TDP-43), los déficits son anotados por rotarod y el reflejo del escape. Más allá de modelos de enfermedad y la terapia génica, existen diversas aplicaciones potenciales para el gene de gran escala dirigidas a descrito aquí. El uso expandido de este método ayudará a acelerar la prueba de las neurociencias y la Neurogenética de hipótesis.
Introduction
Vectores de virus recombinante adeno-asociado (AAV) son herramientas imprescindibles para la investigación del CNS porque son tan eficaces transducción in vivo de neuronas. Los vectores AAV son muy versátiles para estudiar diferentes transgenes e isoformas de la proteína, diferentes tejidos, diferentes especie y diferentes vías de administración. Por ejemplo, AAV puede ser administrado a ratones por un periférico, relativamente no-invasivo, inyección intravenosa para transducir las neuronas en el SNC como primero descrito en Foust et al. y Duque et al. (véase papel de JOVE por Gombash et al. (2014)). 1 , 2 , 3 se utiliza este enfoque de entrega de genes en ratas expresar eficientemente cualquier proteína fluorescente verde (GFP) o la ALS proteínas, respuesta transactive ADN-proteína de 43 kDa (TDP-43) en el SNC. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 trabajo en ratas es significativo porque los parámetros fisiológicos y metabólicos de la rata están más cercanos de los seres humanos en comparación con ratones y hay ensayos conductuales y toxicológicos diseñados específicamente para las ratas. Además, más líneas de ratas transgénicas están volviendo disponibles que puede ser utilizado en estudios de transferencia de genes AAV.
Se detallan métodos expansivos CNS transferencia de genes en la rata y cuantificación rápida y confiable de los resultados. Transducción de CNS de gran escala se utiliza para imitar la sintomatología de la ELA en ratas expresando TDP-43 a lo largo de la médula espinal. El método es inyecciones de vena de cola del vector TDP-43 a ratas adultas jóvenes según lo utilizado en Jackson et al. 6 , 8 , 9 después de varias semanas, déficits motor TDP-43-inducida son marcados por dos métodos: escapar de reflejo y rotarod en Dayton et al. y Jackson et al. 5 , 6 , 7 , 9 para el vector de control GFP, en análisis post-mortem, la zona fluorescente del cerebelo se calcula como un índice de eficiencia de la transducción de señales en Jackson et al. 6 , 8 el análisis del cerebelo ha demostrado para ser un índice rápido y confiable del grado de transducción CNS después de la entrega del gene periférico y debe ser aplicable a una variedad de métodos de transferencia génica de periférica a central.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una variedad de rutas de entrega han sido probados para vectores AAV: intraparenquimal, intra-cerebroventricular, intra-tecal, intravenosa, intranasal, intramuscular, etcetera. Cada ruta puede tener ventajas como inconvenientes. Administración de cola vena de AAV a ratas adultas es un método confiable para lograr la constante de transducción del CNS. El método de inyección periférica evita la introducción de una cánula de inyección en los tejidos de la CNS y por lo tanto es mínimamente invasivo. La expresión e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Asociación de ALS, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx y una donación benéfica para la investigación de ALS de Thomas Lawson, para lo cual estamos agradecidos. Agradecemos a Elysse huerta y Donna Burney para asesoría y capacitación. JAS fue apoyado por la Fundación mintió e institutos nacionales de salud otorgar GM103418.
Materials
| Scale | Pelouze | SP5 | |
| Nalgene bucket | Thermo Scientific | 12014000 | 4000 mL |
| Microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Lactated Ringer's Solution | Baxter Healthcare | 0338-0114-04 | |
| Mini vortexer | Fisher Scientific | 128101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22624415 | |
| Laboratory film | Bemis | PM996 | |
| 1-mL syringe | BD | 309626 | Comes with a 25g needle attached. Replace with 27-30g needle for injection |
| 30g needle | BD | 305106 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | Isoflurane USP 250 mL |
| Anesthesia mask | Kopf Instruments | 906 | |
| Gauze | Henry Schein | 100-2524 | 2" x 2" (5cm x 5cm) |
| Pipet tips | USA Scientific | 1111-0816 | |
| Micropipet | Gilson | 4642080 | |
| Gas anesthesia vaporizer | SurgiVet | 4214322 | Classic T3 |
| Gas anesthesia scavenger | SurgiVet | 32373B10 | Enviro-PURE |
| Heating pad | Sears | 17280 | |
| Bench pad | VWR | 56617-006 | |
| Rotarod | Panlab/Harvard Apparatus | 76-0772 | 4 rats/ 4 mice |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2401 | 140 proof |
| 70% Isopropanol | VWR | 89108-160 | |
| Scion Image | Scion Corporation | ||
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Invitrogen | A11122 | Primary Antibody – 1:500 dilution |
| AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11070 | Secondary Antibody – 1:300 dilution |
| Axioskop 40 microscope | Zeiss |
References
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- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037 (2014).
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