Methoden voor een grootschalige centrale zenuwstelsel gene levering in de rat vallen. In dit voorbeeld is het doel om na te bootsen van een ziekte die het hele ruggenmerg aantast. De wijdverbreide transductie kan worden gebruikt voor een therapeutische eiwitten naar het CNS van een eenmalige, perifere administratie.
Adeno-associated virus (AAV) vectoren zijn een belangrijk reagens in de neurowetenschappen voor geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR), optogenetics, cre-lox doelgerichtheid, enz. Het doel van dit manuscript is om te helpen de onderzoeker probeert genenoverdracht expansieve centrale zenuwstelsel (CNS) in de rat via staart veneuze injectie van AAV. Schaal expressie is relevant voor voorwaarden met wijdverspreide pathologie, en het model van een rat is belangrijk vanwege de grotere omvang en fysiologische overeenkomsten voor de mens ten opzichte van muizen. In dit voorbeeld toepassing, wordt een grootschalige neuronale transductie gebruikt om na te bootsen van een neurodegeneratieve ziekte die het hele ruggenmerg, Amyotrofische laterale sclerose (ALS treft). De efficiënte grootschalige CNS transductie kan ook worden gebruikt voor therapeutische eiwitten factoren in pre-klinische studies. Na een interval na injectie expressie van enkele weken, worden de effecten van de transductie geëvalueerd. Voor een groen fluorescente proteïne (GFP) controle vector, is de hoeveelheid GFP in het cerebellum snel en betrouwbaar geschat door een basic imaging-programma. Voor motor ziekte fenotypen die worden veroorzaakt door het ALS gerelateerde eiwit transactive reactie DNA-bindende eiwit van 43 kDa (TDP-43), worden de tekorten gescoord door ontsnappen reflex en rotarod. Naast ziekte modellering en gentherapie zijn er diverse potentiële toepassingen voor de grootschalige gentargeting hier beschreven. Het uitgebreide gebruik van deze methode zal de steun in de hypothese testen in de neurowetenschappen en neurogenetica bespoedigen.
Recombinante adeno-associated virus (AAV) vectoren zijn onmisbare tools voor CNS onderzoek omdat ze zo efficiënt voor het transducing van neuronen in vivo. AAV vectoren zijn zeer veelzijdig voor het bestuderen van verschillende transgenen en eiwit isoforms, verschillende weefsels, andere host-soorten en andere wijzen van toediening. Bijvoorbeeld, kan AAV worden toegediend aan muizen door een randapparaat, relatief niet-invasieve, intraveneuze injectie transduce neuronen in het centraal zenuwstelsel als eerste beschreven in Foust et al. en Duque et al. (Zie JOVE papieren door Gombash et al. (2014)). 1 , 2 , 3 deze gen levering benadering wordt gebruikt bij ratten efficiënt uitspreken ofwel groen fluorescente proteïne (GFP) of de ALS gerelateerde eiwitten, transactive reactie DNA-bindende eiwit van 43 kDa (TDP-43) in het VNV. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 werkt bij ratten is belangrijk omdat de rat fysiologische en metabolische parameters dichter bij de mensen in vergelijking met muizen zijn en er gedrags- en toxicologische testen zijn speciaal ontworpen voor ratten zijn. Bovendien, steeds meer transgene rat lijnen beschikbaar dat kan worden gebruikt in de AAV gene transfer studies.
Methoden zijn gedetailleerd op expansieve CNS genoverdracht in de rat, en snelle, betrouwbare kwantificering van de resultaten. Grootschalige CNS transductie wordt gebruikt om na te bootsen de symptomatology van ALS bij ratten met het uitspreken van TDP-43 in het ruggenmerg. De methode is staart ader injecties van de TDP-43 vector naar jonge volwassen ratten zoals gebruikt in Jackson et al. 6 , 8 , 9 na enkele weken, TDP-43-geïnduceerde motor tekorten worden gescoord op twee manieren: reflex en rotarod zoals gebruikt in Dayton et al. en Jackson et al. ontsnappen 5 , 6 , 7 , 9 voor het besturingselement GFP vector, in post-mortem analyse, fluorescerende inzake het cerebellum wordt berekend als een index van de transductie efficiëntie zoals gebruikt in Jackson et al. 6 , 8 de analyse van cerebellum heeft bewezen een snelle en betrouwbare index de mate van CNS transductie na levering van de perifere gen en dient te gelden tot een verscheidenheid van benaderingen probeert randapparaat-naar-centrale genenoverdracht.
Een verscheidenheid van levering routes zijn getest voor AAV vectoren: intra-parenchymal, intra-cerebroventricular, intra-thecal, intraveneuze intranasale, intra musculaire, enz. Elke route wellicht specifieke voordelen evenals nadelen. Staart ader toediening AAV aan volwassen ratten is een betrouwbare methode voor het bereiken van overeenstemming transductie van het centraal zenuwstelsel. De perifere injectie methode vermijdt de invoering van een canule injectie in de CNS weefsels en kan daarom minimaal invasieve. De ef…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door de ALS Association, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx en een charitatieve donatie voor ALS onderzoek van Thomas Lawson, waarvoor wij dankbaar zijn. Wij danken Elysse boomgaard en Donna Burney voor advies en training. JAS werd gesteund door de Stichting gelogen en National Institutes of Health verlenen GM103418.
Scale | Pelouze | SP5 | |
Nalgene bucket | Thermo Scientific | 12014000 | 4000 mL |
Microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
Lactated Ringer's Solution | Baxter Healthcare | 0338-0114-04 | |
Mini vortexer | Fisher Scientific | 128101 | |
Centrifuge | Eppendorf | 22624415 | |
Laboratory film | Bemis | PM996 | |
1-mL syringe | BD | 309626 | Comes with a 25g needle attached. Replace with 27-30g needle for injection |
30g needle | BD | 305106 | |
Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | Isoflurane USP 250 mL |
Anesthesia mask | Kopf Instruments | 906 | |
Gauze | Henry Schein | 100-2524 | 2" x 2" (5cm x 5cm) |
Pipet tips | USA Scientific | 1111-0816 | |
Micropipet | Gilson | 4642080 | |
Gas anesthesia vaporizer | SurgiVet | 4214322 | Classic T3 |
Gas anesthesia scavenger | SurgiVet | 32373B10 | Enviro-PURE |
Heating pad | Sears | 17280 | |
Bench pad | VWR | 56617-006 | |
Rotarod | Panlab/Harvard Apparatus | 76-0772 | 4 rats/ 4 mice |
70% Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2401 | 140 proof |
70% Isopropanol | VWR | 89108-160 | |
Scion Image | Scion Corporation | ||
GFP Tag Polyclonal Antibody | Invitrogen | A11122 | Primary Antibody – 1:500 dilution |
AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11070 | Secondary Antibody – 1:300 dilution |
Axioskop 40 microscope | Zeiss |