Descriviamo una tecnica sperimentale che chiamiamo minimamente invasiva muscolo Embedding (MIME), che si basa sull’evidenza che il tessuto muscolare scheletrico contiene cellule miogeniche vitali che possono facilitare la miogenesi donatore-cellula-mediata quando impiantato nel un muscolo di host.
Muscolo scheletrico possiede capacità rigenerativa a causa di tessuto-residente, generazione di fibra muscolare (miogeniche) cellule satelliti (SCs), che può formare nuove fibre muscolari nelle giuste condizioni. Sebbene SCs può essere raccolto da tessuto muscolare e coltivate in vitro, le cellule dei mioblasti risultante non sono molto efficaci nel promuovere la miogenesi quando trapiantate in muscolo di host. Chirurgicamente esponendo il muscolo di host e l’innesto di segmenti di tessuto muscolare donatore, o le fibre muscolari isolate con loro SCs sul muscolo host, promuove la miogenesi migliore rispetto al trapianto di mioblasti. Abbiamo sviluppato una nuova tecnica che noi chiamiamo minimamente invasiva muscolo Embedding (MIME). MIME coinvolge passando un ago chirurgico attraverso il muscolo di host, disegno di un pezzo di tessuto muscolare donatore attraverso la pista dell’ago e poi lasciando il tessuto erogatore incorporato nel muscolo host in modo che possa agire come una fonte di SCs per il muscolo di host. Qui descriviamo in dettaglio i passaggi coinvolti nell’esecuzione di MIME in un modello di topo immunodeficiente che esprime una proteina fluorescente verde (GFP) in tutte le sue cellule. Immunodeficenza nel topo host riduce il rischio di rigetto immunitario del tessuto donatore, ed espressione di GFP consente la facile identificazione delle fibre muscolari di host (GFP +) e donatore-cellula-derivati di fibre muscolari (GFP-). I nostri dati pilota suggeriscono che MIME può essere utilizzato per impiantare un muscolo estensore digitorum lungo (EDL) da un mouse di donatore nel muscolo tibiale anteriore (TA) di un mouse di host. Anche i nostri dati suggeriscono che quando un myotoxin (cloruro di bario, BaCl2) viene iniettato nel muscolo host dopo MIME, ci è prova della miogenesi donatore-cellula-derivati nel muscolo host, con circa 5%, 26%, 26% e 43% delle fibre in un singolo host TA muscolo che mostrano nessun contributo di host, contributo minimo host, host moderato contributo e contributo massimo host, rispettivamente.
Muscolo scheletrico sano, anche se post-mitotici, possiede eccellenti capacità rigenerativa per la presenza di cellule miogeniche residente in tessuto conosciuto come cellule satelliti (SCs)1,2; e rivisti in3,4. Tuttavia, nelle circostanze patologiche causate da distrofie muscolari, traumi o invecchiamento accelerato, la rigenerazione muscolare potrebbe non tenere il passo con la degradazione muscolare, e così, la perdita progressiva della fibra muscolare si verifica5. Anche se sono stati sviluppati metodi efficaci per isolare SCs dal muscolo ed espanderli in coltura per generare un gran numero di mioblasti (e successivamente miotubi), tentativi di generare numeri fisiologicamente rilevanti delle fibre muscolari nel muscolo host hanno ha reso solo successo minimo6. Come con molti altri tipi di cellule, quando mioblasti vengono iniettati da solo nel tessuto ospite, la maggior parte delle cellule non attecchire7,8. Abbiamo dimostrato che la stimolazione elettrica neuromuscolare (NMES) facilita la miogenesi donatore-cellula-derivati nel muscolo del mouse di rigenerazione-carenti host che è stato iniettato con mioblasti umano8. Gli altri hanno dimostrato che chirurgicamente innesto muscolo biopsiato o singole fibre muscolari con annesso SCs, facilitare la miogenesi moderata anche senza NMES, suggerendo che l’impianto di fibre di muscolo intere con SCs potrebbe essere più vantaggioso di impiantare cellule miogeniche da solo9,10. Dal donatore o tessuto muscolare ingegnerizzato innestati nel muscolo host produce risultati migliori rispetto a trapianto di cellule da solo, è possibile che il tessuto o tessuto-come le strutture potrebbero fornire spunti cruciale per engraftment donatore-cellula; un concetto che sta diventando sempre più evidente negli studi di terapia cellulare che coinvolge vari cella tipi10,11,12.
Dati recenti suggeriscono che SCs ottenuti dagli esseri umani più di 2 settimane post-mortem generare miotubi in coltura13. Abbiamo quindi intenzione di valutare se l’impianto di muscolo tessuto raccolto post mortem in un ospite vivente sarà invertire la perdita di fibre muscolari. Abbiamo sviluppato una nuova tecnica chiamata MIME per impiantare il tessuto muscolare donatore nel tessuto del muscolo scheletrico di un ospite vivente al fine di promuovere la miogenesi donatore-cellula-derivati. MIME implica il passaggio di un ago chirurgico attraverso il muscolo di host per creare una pista dell’ago; disegno di un piccolo segmento del tessuto muscolare donatore attraverso la pista dell’ago; lasciando il tessuto erogatore incorporato nel muscolo host; e chiusura dei fori di spillo con adesivo del tessuto. Dopo che pratica la tecnica nei topi eutanasizzati studiato in altri esperimenti, abbiamo ora hanno effettuato MIME in topi dal vivo che sono immunodeficienti ed ubiquitariamente esprimere una proteina fluorescente verde (GFP), e follow-up a 3 e 14 giorni post-MIME. Alle 3 giorni post-MIME, confermiamo che muscolo EDL di donatore del mouse (GFP-) impiantato in mouse host del muscolo (GFP +) TA, resti incorporati nel muscolo host. A post-MIME 14 giorni, dopo l’infortunio di BaCl2 myotoxin per indurre danni e miogenesi, confermiamo che circa 5%, 26%, 26% e 43% delle fibre in un singolo host muscolo TA non mostrano nessun contributo di host, contributo minimo host, host moderata contributo e maximal host contributo, rispettivamente. Nucleazione centrale (un indicatore di degenerazione e successiva rigenerazione) è visto in circa il 95% delle fibre muscolari TA dopo l’iniezione di MIME e myotoxin.
Studiamo i muscoli TA 14 giorni dopo MIME + BaCl2 perché questo punto di tempo acquisisce lo stadio intermedio della rigenerazione, quando una maggioranza delle fibre rigenerate sono centralmente nucleate. Studiamo la GFP + topi come host per MIME, quando alla fine si trapiantare muscolo cadaverico umano nei topi di host, saremo in grado di distinguere facilmente le fibre muscolari di origine host e donatore. Usiamo il mouse del muscolo EDL come il tessuto erogatore sperimentale, poiché le singole fibre da questo muscolo hanno dimostrato una maggiore potenziale myogenic di TA muscoli9. Il muscolo EDL è anche sinergico al muscolo TA e ha composizione simile tipo di fibra. I nostri dati preliminari suggeriscono che MIME è in grado di facilitare la miogenesi donatore-cellula-derivati nel muscolo host.
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la tecnica sperimentale romanzo noto come MIME, sviluppata nel nostro laboratorio, per impiantare il tessuto muscolare donatore nel tessuto muscolare ospite. Si tratta di un adattamento di un muscolo aperto l’innesto di tecnica che ha già dimostrato di essere efficace nella promozione della miogenesi donatore-cellula-mediata in un host muscolo9,10,17.
L’obiettivo di MIME è non per abilitare attecchimento del donatore tessuto del muscolo stesso nel muscolo host (attualmente non sappiamo se in questo caso), ma piuttosto di fornire una fonte di donatore SCs che possono contribuire alla miogenesi nel muscolo host sotto condizioni che stimolano m uscle rigenerazione. La nostra speranza è che dopo MIME è stato ottimizzato e testato in studi di base e preclinici, potrebbe fornire spunti preziosi per guidare le terapie cliniche finalizzate ad aumentare la rigenerazione muscolare in muscoli scheletrici che hanno subito la perdita muscolare myogenic.
Ci sono numerose domande che devono ancora essere risolte per quanto riguarda come MIME potrebbe essere tradotta in una terapia clinica, ad esempio: come sarebbe controllare la qualità del tessuto del donatore? Come sarebbe controllare il rigetto immunitario del donatore di tessuti e cellule? È il tessuto di donatore cancellato dopo fornire alle cellule per miogenesi e lascia dietro una cicatrice fibrotica? Il tipo di fibra del muscolo di donatore e/o host influisce la miogenesi donatore-cellula-mediata? Quali muscoli praticamente possono beneficiare di MIME? Attualmente stiamo ampliando i nostri studi per valutare se MIME è sicuro ed efficace, per identificare i trattamenti aggiuntive che possono aumentare la miogenesi donatore-derivati e rispondere a molte delle domande, sopra elencate.
Dopo aver completato il nostro test di trapianto allogeneic del mouse-a-mouse con MIME, il nostro prossimo passo è quello di eseguire umani-a-mouse MIME con tessuto cadaverico umano per valutare il potenziale myogenic del tessuto muscolare cadaverico. Ci aspettiamo che questi esperimenti porterà ad una nuova linea di ricerca di base e traslazionale, che coinvolge il tessuto del muscolo da donatori, che sono registrati a iniziative come il programma del lascito di corpo per l’educazione e il programma del dono della vita per la donazione di organi .
Rappresentativo dei dati presentati in questo manoscritto suggeriscono che a 14 giorni dopo MIME, ci sono parecchi myofibers vitali che mancano di GFP o hanno bassi livelli di GFP. La nostra interpretazione di questi dati è che le cellule satellite di GFP-donatore ha contribuito alla miogenesi nel muscolo host. Abbiamo effettuato questo esperimento in preparazione per l’impianto di tessuto cadaverico umano in un muscolo di mouse host. Per dimostrare inequivocabilmente che le cellule del donatore satellitare contribuiscono alla miogenesi nel muscolo host seguendo MIME, sarebbe utile per l’impianto del tessuto donatore che esprime un reporter fluorescente, che può essere facilmente distinto dal GFP (ad es., rossa proteina fluorescente esprimendo impiantato nel muscolo di GFP + host del tessuto donatore).
Questa tecnica è limitata principalmente dalla natura di SCs presenti nel tessuto del donatore. Se il SCs nel tessuto del donatore è vitale, che la tecnica è che può agevolare la miogenesi donatore-cellulo-mediata, mentre se non sono vitali, non può verificarsi la miogenesi. Tuttavia, poiché SCs sono molto resistenti e sono vitali per circa 2 settimane post-mortem, è molto probabile che per gli scopi sperimentali, il tessuto di donatore che viene impiantato in pochi minuti dopo il raccolto faciliterà donatore-cellula-mediata miogenesi13 . Inoltre, come accennato sopra, è possibile che dal tessuto del muscolo intero (che contiene SCs, matura le fibre muscolari, così come muscolo-residente fibroblasti) è incorporato nel muscolo host, potrebbe verificarsi la fibrosi. Tuttavia, questa ipotesi deve essere esaminato empiricamente. La letteratura sui danni muscolari derivanti da contrazioni pregiudizievole, cryoinjury e sperimentale myotoxins, suggerisce che le cellule immuni (principalmente macrofagi) sono in grado di efficacemente sgombero detriti cellulari da fibre danneggiate e rimodellamento del matrice extracellulare18. Pertanto, è possibile che dopo l’iniezione di MIME e BaCl2 , finché le cellule immuni ospite hanno accesso alla degenerazione fibre muscolari donatore potrebbe cancellare detriti, lasciando dietro di sé solo il donatore SCs. Infine, nella misura della miogenesi donatore-derivati è dipenda dalla quantità di tessuto muscolare di donatore che è incorporato nel muscolo host. In ordine per il vano di muscolo di host essere completamente ripopolato da donatore-cellula-derivati miofibre, sarebbe necessario un metodo come irradiazione X o gamma di ablazione muscolo host SCs e anche richiedono procedure ripetute di MIME.
È stato dimostrato che esporre chirurgicamente un muscolo di host e la sutura di un pezzo di tessuto erogatore sul muscolo del host può agevolare la miogenesi donatore-cellula-mediata9,10,17. Questo approccio chirurgico aperto è stato utilizzato in passato per monitorare la progressione della miogenesi e generare modelli murini di malattie del muscolo umano. L’aspetto innovativo della tecnica del MIME è che è come minimo dilagante e non coinvolge chirurgicamente esponendo il muscolo di host. Questo riduce il rischio di infezione iatrogenica e il grado di disagio nell’animale ospite, rendendolo quindi più fattibile per eseguire ripetutamente MIME sul muscolo stesso host, se necessario.
Possiamo anticipare che la tecnica MIME potrebbe essere un affinamento adatto per il metodo chirurgico aperto è attualmente seguito per impiantare il tessuto muscolare donatore in un mouse di host. Questo potrebbe accelerare la generazione di modelli murini umanizzati, incorporando muscolo biopsiato umano nel muscolo del mouse host. Inoltre, basata sui nostri dati preliminari da innesto del mouse-a-mouse, anticipiamo che MIME sarà efficace nel raggiungere la miogenesi donatore-cellula-mediata dal tessuto donatore cadaverico umano come donatore SCs sono vitali. Infine, con ulteriori test e validazione, speriamo che la tecnica MIME aiuterà a sviluppare nuove terapie per facilitare la miogenesi donatore-cellula-mediata in esseri umani con le malattie muscolari.
Il successo della tecnica MIME dipende criticamente proprio incorporamento del tessuto donatore all’interno del compartimento Fascia (epimysium) del muscolo del host. Solo se il tessuto del donatore viene inserito all’interno del compartimento muscolare host, sarà in grado di fornire SCs al muscolo di host in modo preciso. Se il tessuto del donatore viene inserito di fuori del muscolo di host, non è chiaro quale sarebbe il suo destino. Nel nostro modello sperimentale per MIME, usiamo il muscolo TA come il muscolo di host, dal momento che è prominente e superficialmente collocato nella parte anterolaterale della gamba. Le dimensioni, l’orientamento e la posizione anatomica del muscolo TA, lo rende facile confermare che il tessuto del donatore sia posizionato correttamente all’interno del muscolo di host TA dopo MIME. In questa carta, abbiamo fornito la prova sperimentale che il tessuto del donatore realimentazione incorporati all’interno di host muscolo TA a 3 giorni post-MIME e che non c’è donatore-cellula-mediata miogenesi nel muscolo host alle 14 giorni post-MIME.
The authors have nothing to disclose.
Quest’opera è stata permessa da una sovvenzione di pilota dall’Alleanza per rigenerativa riabilitazione ricerca e formazione (AR3T) e un pacchetto di avvio di facoltà presso la Wayne State University a vaso. AR3T è supportato da Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e Human Development (NICHD), Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo (NINDS) e Istituto nazionale di Imaging biomedico e Bioingegneria (NIBIB ) degli istituti nazionali di salute sotto Premio numero P2CHD086843. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
NSG-GFP mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #021937 | Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein |
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #000664 | Control donor mice |
Tabletop isoflurane vaporizer | VetEquip (Livermore, CA) | Item #901801 | Inhaled anesthesia system |
Magic depilatory crea | Softsheen Carson (New York, NY) | N/A | Razorless hair removal cream |
4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures | Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD) | SUT106631 | Guiding sutures for donor tissue |
VetBond veterinary tissue adhesive | 3M (Maplewood, MN) | Catalog #1469Sb | Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure |
Barium chloride | Ricca Chemical Company (Arlington, TX) | Product #R0854000-500A 854-16 | Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration |
Deltaphase isothermal gel heating pad | Braintree Scientific (Braintree, MA) | Item #39DP | Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia |
HM525NX cryostat | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog #HM525NX | Cryostat to make frozen sections of muscle |
Vectashield Antifade Medium | Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) | Catalog Number: H-1000 | Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples |
Rabbit anti Desmin Antibody | Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA) | RB9014P | Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling |
Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog#: A-21069 | Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Seracare (Milford, MA) | Catalog #5930-0006 or 71-03-01 | Reagent for fluorescent labeling of nuclei |
Axio Scope.A1 microscope | Carl Zeiss (Peabody, MA) | Product #Axio Scope.A1 | Light and fluorescence microscope |
Photoshop CS4 | Adobe Systems (San Jose, CA) | Photoshop CS4 | Imaging Software for perform image tiling |
Image J | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | Image J for Windows 64-bit Operating System | Imaging Software for quantitative fluorescence analysis |