يصف لنا تقنية تجريبية رواية أن نسميه الحد الأدنى الغازية العضلات التضمين (MIME)، الذي يستند إلى الأدلة أن أنسجة العضلات الهيكلية تحتوي على خلايا شذوذ قابلة للتطبيق يمكن أن تسهل ميوجينيسيس خلية توسطت المانحة عند زرعها في عضلة مضيف.
الهيكل العظمى والعضلات تمتلك قدرة التجدد بسبب المقيم في الأنسجة, مدرة من الألياف العضلية (شذوذ) الأقمار الصناعية خلايا (SCs)، التي يمكن أن تشكل ألياف العضلات جديدة تحت الظروف المناسبة. على الرغم من أن يمكن حصادها من أنسجة العضلات المنبوذة ومثقف في المختبر، الخلايا ميوبلاست الناتجة ليست فعالة جداً في تعزيز ميوجينيسيس عند زرعها في العضلات المضيف. جراحيا تعريض عضلة المضيف وترقيع أجزاء من أنسجة العضلات المانحة، أو ألياف العضلات معزولة مع تلك الطوائف المنبوذة على المضيف والعضلات، وتعزز ميوجينيسيس أفضل مقارنة بزرع ميوبلاست. قمنا بتطوير تقنية رواية التي نسميها الحد الأدنى الغازية العضلات التضمين (MIME). MIME ينطوي على تمرير إبرة جراحية من خلال العضلات المضيف ورسم قطعة من الأنسجة العضلية المانحين من خلال مسار الإبرة ثم ترك الأنسجة المانحة جزءا لا يتجزأ من العضلة المضيف حيث أنها قد تكون بمثابة مصدر للطوائف المنبوذة للعضلات المضيف. هنا يصف لنا بالتفصيل الخطوات التي تشترك في أداء MIME في طراز ماوس العوز التي تعرب عن بروتين فلوري أخضر (التجارة والنقل) في جميع خلاياه. نقص المناعة المكتسب في الماوس المضيف يقلل من خطر الرفض المناعي للأنسجة المانحين، وتعبير بروتينات فلورية خضراء يتيح سهولة تحديد المضيف ألياف العضلات (بروتينات فلورية خضراء +) والمستمدة من الخلية المانحة ألياف العضلات (بروتينات فلورية خضراء-). لدينا البيانات التجريبية تشير إلى أنه يمكن استخدام MIME زرع عضلة طويلة (مؤسسة كهرباء لبنان) أصابع باسطة من ماوس مانحة في العضلات (تا) الظنبوبي الأمامي على فأرة الحاسوب المضيف. البيانات المتوفرة لدينا تشير أيضا إلى أنه عندما يتم حقن ميوتوكسين (كلوريد الباريوم، BaCl2) في العضلات المضيف بعد MIME، هناك أدلة ميوجينيسيس المستمدة من الخلية المانحة في العضلات المضيفة، مع حوالي 5%، 26%، 26% و 43% من الألياف في مضيف واحد تا العضلات تظهر لا مساهمة المضيف والمضيفة أدنى مساهمة، ومساهمة المضيف معتدلة ومساهمة المضيف القصوى، على التوالي.
صحة الهيكل العظمى والعضلات، حتى ولو بعد الانقسامية، تمتلك قدرة التجدد ممتازة بسبب وجود خلايا الأنسجة-المقيم شذوذ المعروفة باسم الخلايا الأقمار الصناعية (المنبوذة)1،2؛ واستعرضت في3،4. غير أن الظروف المرضية الناجمة عن ضمور العضلات، الصدمات النفسية أو الشيخوخة المتسارعة، وتجديد العضلات قد لا مواكبة انهيار العضلات، وهكذا، يحدث فقدان الألياف العضلية التدريجي5. على الرغم من أن قد وضعت أساليب فعالة لعزل الطوائف المنبوذة من العضلات وتوسيعها في الثقافة لتوليد إعداد كبيرة من ميوبلاستس (وفي وقت لاحق myotubes)، قد محاولات لتوليد الأرقام ذات الصلة فسيولوجيا من ألياف العضلات في العضلات المضيف أسفرت عن نجاح الحد الأدنى فقط6. كما مع العديد من أنواع الخلايا الأخرى، عندما يتم حقن myoblasts وحدها في أنسجة المضيف، ومعظم الخلايا لا انجرافت7،8. وقد أظهرنا أن التحفيز الكهربائي العضلية (NMES) يسهل ميوجينيسيس المستمدة من الخلية المانحة في العضلات الماوس المضيفة تفتقر إلى التجديد التي تم حقن مع ميوبلاستس البشرية8. الآخرين قد أثبتت أن العضلات فحص تطعيم جراحيا أو ألياف العضلات واحدة مع الطوائف المنبوذة المرفقة، تيسير ميوجينيسيس معتدلة حتى بدون NMES، مما يوحي بأن غرس كله ألياف العضلات مع الطوائف المنبوذة قد يكون أكثر فائدة من غرس شذوذ الخلايا وحدها9،10. منذ الجهات المانحة أو أنسجة العضلات هندسيا المطعمة في العضلات المضيف تنتج نتائج أفضل من زرع الخلايا وحدها، فمن الممكن أن الأنسجة أو هياكل مثل الأنسجة قد توفير إشارات حاسمة من أجل engraftment الخلية المانحة؛ مفهوم الذي يتضح بشكل متزايد في علاج الخلايا دراسات تشمل الخلية مختلف أنواع10،،من1112.
البيانات الأخيرة تشير إلى أن الطوائف المنبوذة التي تم الحصول عليها من البشر أكثر من أسبوعين بعد الوفاة توليد ميوتوبيس في الثقافة13. ولذلك نحن عازمون على تقييم ما إذا كان سيتم عكس غرس العضلات أنسجة تحصد الجثة إلى مضيف معيشة فقدان الألياف العضلية. قمنا بتطوير تقنية جديدة تسمى MIME زرع أنسجة العضلات المانحة إلى أنسجة العضلات الهيكلية من مضيف المعيشة من أجل تعزيز ميوجينيسيس المستمدة من الخلية المانحة. MIME ينطوي على تمرير إبرة جراحية من خلال العضلات المضيفة لإنشاء مسار إبرة؛ رسم شريحة صغيرة من أنسجة العضلات المانحة خلال المسار إبرة؛ ترك الأنسجة المانحة جزءا لا يتجزأ من العضلات المضيفة؛ وإغلاق الثقوب إبرة مع لاصق الأنسجة. بعد ممارسة هذا الأسلوب في الفئران euthanized درس في تجارب أخرى، الآن بإجراء MIME في الفئران الحية التي العوز ونعرب عن أوبيكويتوسلي بروتين فلوري أخضر (التجارة والنقل)، والمتابعة في 3 و 14 يوما بعد انتهاء MIME. في MIME بعد 3 أيام، ونحن نؤكد أن المانحين الماوس (بروتينات فلورية خضراء-) مؤسسة كهرباء لبنان العضلات مزروع في الماوس المضيف (بروتينات فلورية خضراء +) تا العضلات، يظل جزءا لا يتجزأ من العضلات المضيف. في MIME بعد 14 يوما، بعد إصابة ميوتوكسين2 BaCl للحث على الأضرار وميوجينيسيس، أننا نؤكد أن حوالي 5%، 26%، 26% و 43% من الألياف في مضيف واحد العضلات تا إظهار لا مساهمة المضيف، مساهمة المضيف الحد الأدنى، والمضيف معتدل مساهمة، والأعلى مساهمة، المضيف على التوالي. ويعتبر التنو المركزية (علامة انحطاط وتجديد لاحقة) في حوالي 95% ألياف العضلات تا بعد حقن MIME وميوتوكسين.
نحن دراسة العضلات تا 14 يوما بعد MIME + BaCl2 لأن هذه النقطة من الوقت يلتقط المرحلة المتوسطة للتجديد، عندما يتم مركزياً المنبسطة أغلبية من الألياف المجددة. نقوم بدراسة التجارة والنقل + الفئران كمضيفين ل MIME، حتى أنه عندما نحن في نهاية المطاف زرع الأعضاء البشرية العضلات المأخوذة في الفئران المضيف، أننا سوف تكون قادرة على سهولة التمييز بين ألياف العضلات من أصل البلدان المضيفة والمانحة. نحن استخدام الماوس العضلات مؤسسة كهرباء لبنان الأنسجة المانحة التجريبية، حيث أظهرت الألياف واحدة من هذه العضلة إمكانات شذوذ أكبر من العضلات تا9. عضلة مؤسسة كهرباء لبنان هو أيضا التآزري للعضلات تا وتكوين الألياف من نوع مماثل. أن البيانات الأولية تشير إلى أن MIME قادرة على تيسير ميوجينيسيس المستمدة من الخلية المانحة في العضلات المضيف.
نقدم هنا، بروتوكول مفصل لتقنية تجريبية الرواية المعروفة MIME، نمواً في المختبر، زرع أنسجة العضلات المانحة إلى أنسجة العضلات المضيف. وهذا هو تكييف العضلات مفتوحة تطعيم الأسلوب الذي قد ثبت بالفعل أن تكون فعالة في تشجيع الجهات المانحة-خلية-توسط ميوجينيسيس في مضيف العضلات9،،من1017.
وهدف MIME هو عدم تمكن engraftment أنسجة العضلات المانحة نفسها في العضلات المضيف (حاليا لا نعرف إذا كان هذا يحدث)، ولكن بدلاً من ذلك على توفير مصدر للمانحين المنبوذة التي يمكن أن تسهم في ميوجينيسيس في العضلات المضيف تحت الظروف التي تحفز م تجديد أوسكلي. وأملنا هو أن بعد تم الأمثل MIME واختبارها في الدراسات الأساسية والاكلينيكية، يمكن أن توفر معلومات قيمة لتوجيه العلاجات السريرية تهدف إلى زيادة تجديد العضلات في عضلات الهيكل العظمى التي خضعت لفقدان العضلات شذوذ.
وهناك العديد من الأسئلة التي لا يزال يتعين الإجابة عليها فيما يتعلق بكيفية MIME يمكن أن تترجم إلى علاج السريري، وعلى سبيل المثال: كيف يمكننا مراقبة نوعية الأنسجة المانحة؟ كيف يمكننا التحكم الرفض المناعي للخلايا والأنسجة المانحة؟ يتم مسح الأنسجة المانحة بعد توفير الخلايا ميوجينيسيس أو أنه ترك ندبة تليفية؟ هل يؤثر نوع ألياف العضلات المانحة و/أو المضيف ميوجينيسيس خلية توسطت المانحة؟ العضلات التي يمكن أن تستفيد عمليا من MIME؟ ونقوم حاليا بتوسيع لدينا دراسات تقييم ما إذا كان MIME آمنة وفعالة، وتحديد العلاجات مرافقة التي يمكن زيادة ميوجينيسيس المستمدة من الجهات المانحة، والإجابة على العديد من الأسئلة، المذكورة أعلاه.
بعد الانتهاء من تجاربنا من الماوس لزرع متمكنة مع MIME، خطوتنا التالية لأداء MIME الإنسان للماوس مع الأنسجة البشرية المأخوذة لتقييم إمكانات شذوذ أنسجة العضلات المأخوذة. ونتوقع أن تؤدي هذه التجارب إلى خط جديد للبحوث الأساسية ومتعدية الجنسيات، الذي ينطوي على أنسجة العضلات من الجهات المانحة، التي تسجل في مبادرات مثل “البرنامج وصية الهيئة” للتعليم والبرنامج “هدية من الحياة” للتبرع بالأعضاء .
ممثلة من البيانات المعروضة في هذه المخطوطة تشير إلى أن 14 يوما بعد MIME، هناك عدة ميوفيبيرس قابلة للحياة التي تفتقر إلى التجارة والنقل أو مستويات منخفضة من التجارة والنقل. وتفسيرنا لهذه البيانات أن الخلايا الأقمار الصناعية التجارة والنقل والجهات المانحة ساهمت في ميوجينيسيس في العضلات المضيف. ونحن إجراء هذه التجربة استعدادا لزرع الأنسجة البشرية المأخوذة في العضلات ماوس مضيف. ليثبت دون لبس أن الخلايا الأقمار الصناعية المانحة المساهمة في ميوجينيسيس في العضلات المضيف بعد MIME، سيكون من المفيد زرع الأنسجة المانحة التي تعرب عن مراسل نيون، التي يمكن تمييزها بسهولة من التجارة والنقل (مثلاً، الأحمر نيون البروتين معربا عن الأنسجة المانحة مزروع في التجارة والنقل + العضلات المضيف).
ويحد هذا الأسلوب أساسا طبيعة الطوائف المنبوذة في الأنسجة المانحين. إذا المنبوذة في الأنسجة المانحة قابلة للتطبيق، التقنية التي من المرجح أن تيسير ميوجينيسيس خلية توسطت المانحين، في حين إذا لم تكن قابلة للاستمرار، ولا تحدث ميوجينيسيس. ومع ذلك، منذ المنبوذة جداً مرنة وقابلة للتطبيق لحوالي 2 أسابيع بعد الوفاة، أنه من المحتمل جداً أن تيسر الأنسجة المانحين التي تم زرعها في غضون دقائق قليلة بعد الحصاد لأغراض تجريبية، خلية توسطت المانحة ميوجينيسيس13 . بالإضافة إلى ذلك، وكما أشير أعلاه، فمن الممكن أنه منذ النسيج العضلي كله (الذي يحتوي على الطوائف المنبوذة، وألياف العضلات ناضجة، فضلا عن المقيمين العضلات الليفية) مضمن في العضلات المضيف، يمكن أن يحدث التليف. ومع ذلك، هذا الافتراض يحتاج إلى دراسة تجريبية. الأدب في العضلات الضرر الناجم عن تقلصات الضارة، وكريوينجوري، وميوتوكسينس التجريبية، يوحي بأن الخلايا المناعية (أساسا الضامة) قادرة على إزالة الحطام الخلوية من الألياف التالفة ويعيد البناء بفعالية 18من المصفوفة خارج الخلية. ولذلك، فمن الممكن أن بعد حقن2 MIME و BaCl، طالما الخلايا المناعية المضيف الحصول على ألياف العضلات المانحة تردي، أنهم يمكن مسح الحطام، تاركين وراءهم فقط الجهة المانحة المنبوذة. أخيرا، مدى ميوجينيسيس المستمدة من المانحين يعتمد على مقدار أنسجة العضلات المانحة المضمنة في العضلات المضيف. في ترتيب لحجرة العضلات المضيف يكون repopulated تماما من ميوفيبيرس المستمدة من الخلية المانحة، يتطلب أسلوب مثل التشعيع X أو أشعة غاما يجتذ المضيف العضلات المنبوذة وتتطلب أيضا إجراءات MIME المتكررة.
وقد ثبت أن جراحيا تعريض عضلة مضيف وخياطة قطعة من الأنسجة المانحين على العضلات المضيف يمكن أن ييسر خلية توسطت المانحة ميوجينيسيس9،،من1017. هذا النهج الجراحية المفتوحة قد استخدمت في الماضي لتعقب تقدم ميوجينيسيس وتوليد نماذج الماوس من أمراض العضلات البشرية. الجانب الابتكاري لتقنية MIME هو أنه يتم كسبها ولا تنطوي على تعريض عضلة المضيف جراحيا. وهذا يقلل من خطر العدوى علاجية المنشأ والدرجة من عدم الراحة في الحيوان المضيف، وبالتالي جعلها أكثر جدوى لتنفيذ MIME مرارا وتكرارا على العضلات المضيف نفسه إذا لزم الأمر.
نحن نتوقع أن تقنية MIME قد صقل مناسبة للنهج الجراحية المفتوحة المتبع حاليا زرع أنسجة العضلات المانحة إلى ماوس مضيف. وهذا يمكن أن يعجل توليد نماذج الماوس أنسنة، عن طريق تضمين فحص العضلات البشرية في العضلات الماوس المضيف. بالإضافة إلى ذلك، استناداً إلى البيانات الأولية من الماوس لتطعيم، ونحن نتوقع أن MIME ستكون فعالة في تحقيق ميوجينيسيس المانحة الخلية-بوساطة من الأنسجة البشرية المأخوذة من الجهات المانحة ما دامت قابلة للمانحين المنبوذة. وأخيراً، مع إجراء اختبارات إضافية، والتحقق من صحة، نأمل أن تقنية MIME سيساعد في تطوير علاجات جديدة لتسهيل ميوجينيسيس المانحة-خلية-توسط في البشر المصابين بأمراض العضلات.
أن نجاح هذا الأسلوب MIME يتوقف بصورة حاسمة على التحديد تضمين الأنسجة المانحين داخل المقصورة اللفافي (ابيميسيوم) للعضلات المضيف. إلا إذا تم وضع الأنسجة المانحين داخل حجرة العضلات المضيف، سوف تكون قادرة على تقديم الطوائف المنبوذة للعضلات المضيف بشكل دقيق. إذا تم وضع الأنسجة المانحة خارج العضلات المضيف، أنها غير واضحة بشأن ما سيكون مصيرها. في نموذجنا التجريبي ل MIME، نستخدم العضلات تا كالعضلات المضيف، نظراً لأنها بارزة وسطحي يوضع في الجانب أنتيرولاتيرال من الساق. حجم واتجاه وموقف التشريحية للعضلات تا، يجعل من السهل لتأكيد أن الأنسجة المانحة يتم وضعها بشكل صحيح داخل عضلة المضيف تا بعد MIME. في هذه الورقة، وقد قدمنا الأدلة التجريبية أن الأنسجة المانحة إعادةأنابيب المضمنة في المضيف العضلات تا في MIME بعد 3 أيام، وأن هناك من ميوجينيسيس خلية توسطت المانحين في العضلات المضيف في MIME بعد 14 يوما.
The authors have nothing to disclose.
هذا العمل أمكن “منحة الطيار” من التحالف للتجدد تأهيل البحث والتدريب (ع3T) ومجموعة بدء التشغيل كلية من جامعة ولاية وين بجرة. AR3T تدعمه يونيس كينيدي شرايفر الوطني معهد صحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية و “السكتة الدماغية” (NINDS)، والوطني معهد للطب الحيوي التصوير و “الهندسة الحيوية” (نيبيب ) من المعاهد الوطنية للصحة بموجب قرار التحكيم رقم P2CHD086843. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية “المعاهد الوطنية للصحة”.
NSG-GFP mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #021937 | Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein |
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #000664 | Control donor mice |
Tabletop isoflurane vaporizer | VetEquip (Livermore, CA) | Item #901801 | Inhaled anesthesia system |
Magic depilatory crea | Softsheen Carson (New York, NY) | N/A | Razorless hair removal cream |
4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures | Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD) | SUT106631 | Guiding sutures for donor tissue |
VetBond veterinary tissue adhesive | 3M (Maplewood, MN) | Catalog #1469Sb | Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure |
Barium chloride | Ricca Chemical Company (Arlington, TX) | Product #R0854000-500A 854-16 | Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration |
Deltaphase isothermal gel heating pad | Braintree Scientific (Braintree, MA) | Item #39DP | Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia |
HM525NX cryostat | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog #HM525NX | Cryostat to make frozen sections of muscle |
Vectashield Antifade Medium | Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) | Catalog Number: H-1000 | Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples |
Rabbit anti Desmin Antibody | Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA) | RB9014P | Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling |
Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog#: A-21069 | Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Seracare (Milford, MA) | Catalog #5930-0006 or 71-03-01 | Reagent for fluorescent labeling of nuclei |
Axio Scope.A1 microscope | Carl Zeiss (Peabody, MA) | Product #Axio Scope.A1 | Light and fluorescence microscope |
Photoshop CS4 | Adobe Systems (San Jose, CA) | Photoshop CS4 | Imaging Software for perform image tiling |
Image J | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | Image J for Windows 64-bit Operating System | Imaging Software for quantitative fluorescence analysis |