Wir beschreiben eine neuartige experimentelle Technik, die nennen wir Minimal Invasive Muskel einbetten (MIME), basiert auf dem Beweis Skelettmuskelgewebe lebensfähige myogen Zellen enthält, die Spender-Zell-vermittelten Myogenesis bei implantiert erleichtern können Ein Host-Muskel.
Skelettmuskel besitzt Regenerationsfähigkeit durch Gewebe-Resident, Muskel-Faser-Generierung (myogen) Satelliten-Zellen (SCs), die neuen Muskelfasern unter den richtigen Bedingungen bilden können. Obwohl SCs aus Muskelgewebe geerntet werden können und in Vitrokultiviert, sind die daraus resultierenden Myoblast Zellen nicht sehr effektiv bei der Förderung von Myogenesis wenn in Host Muskel verpflanzt. Chirurgisch Freilegung des Host-Muskels und Pfropfung Segmente des Spenders Muskelgewebe oder isolierter Muskelfasern mit ihren SCs auf Host Muskel, fördert die bessere Myogenesis im Vergleich zu Myoblast Transplantation. Wir haben eine neuartige Technik entwickelt, die wir Minimal Invasive Muskel einbetten (MIME) nennen. MIME beinhaltet Übergabe einer chirurgischen Nadel durch den Host-Muskel, zeichnen ein Stück Muskel Spendergewebe Durchgangsgleis Nadel und dann verlassen das Spendergewebe in der Host-Muskel eingebettet, so dass es als eine Quelle der SCs für den Host-Muskel fungieren kann. Hier beschreiben wir ausführlich die Schritte bei der Durchführung von MIME in einem immungeschwächte Mausmodell, die ein grünes fluoreszierendes Protein (GFP) ausdrückt, in allen seinen Zellen. Immunschwäche in der Host-Maus reduziert das Risiko der Immunabwehr das Spendergewebe, und GFP Ausdruck ermöglicht einfache Identifizierung der Host Muskelfasern (GLP +) und Spender Zelle abgeleitet Muskelfasern (GFP-). Unser pilot Daten zufolge MIME verwendet werden, um ein Beinstrecker m.digitorum Longus (EDL) Muskel von einem Spender-Maus in den m. Tibialis anterior (TA) Muskel Mausklick Host Implantat. Unsere Daten deuten auch, dass wenn ein Myotoxin (Barium Chlorid, BaCl2) nach MIME in der Host-Muskel injiziert wird, gibt es Anzeichen für Spender-abgeleitete Myogenesis in der Host-Muskulatur, mit ca. 5 %, 26 %, 26 % und 43 % der Fasern in einem einzigen Host TA Muskel zeigen keine Host Beitrag, minimale Host Beitrag moderate Host Beitrag und maximale Host Beitrag bzw..
Gesunde Skelettmuskulatur, obwohl nach dem mitotischen besitzt ausgezeichnete Regenerationsfähigkeit aufgrund des Vorhandenseins von Gewebe-Resident myogen Zellen bekannt als Satellitenzellen (SCs)1,2; und in3,4überprüft werden. Jedoch unter pathologischen Bedingungen verursacht durch Muskeldystrophien, Trauma oder beschleunigte Alterung der Muskelregeneration kann nicht mithalten mit Muskelabbau, und progressive Muskelfaser Verlust tritt somit5. Obwohl wirksame Methoden entwickelt wurden, um SCs von Muskel zu isolieren und in der Kultur, große Anzahl von Myoblasten (und später Myotubes) generieren zu erweitern, haben Versuche, physiologisch relevanten Anzahl von Muskelfasern im Host Muskel generieren ergab nur minimalen Erfolg6. Wie mit vielen anderen Zelltypen, wenn Myoblasten Wirtsgewebe, alleine injiziert werden die meisten Zellen nicht7,8Einheilungschancen. Wir haben gezeigt, dass Neuromuskuläre Elektrostimulation (NMES) Spender-abgeleitete Myogenesis in Host Regeneration-defizienten Maus Muskel ermöglicht, die mit menschlichen Myoblasten8injiziert wurde. Andere haben gezeigt, dass chirurgisch Pfropfen biopsiert Muskel- oder einzelne Muskelfasern mit angehängten SCs erleichtern moderate Myogenesis auch ohne NMES, darauf hindeutet, dass ganze Muskelfasern mit SCs Implantation möglicherweise vorteilhafter als die Implantation myogen Zellen allein9,10. Da Spender oder veränderter Muskelgewebe veredelt in Host Muskel bessere Ergebnisse als die Transplantation von Zellen allein produziert, ist es möglich, dass Gewebe oder Gewebe-artige Strukturen entscheidende Hinweise für Spender-Zelle Engraftment bieten könnte; ein Konzept, das in Zell-Therapie-Studien mit verschiedenen Zelle Arten10,11,12immer deutlicher wird.
Aktuellen Daten geht hervor, dass SCs erhalten von Menschen, die mehr als 2 Wochen post-mortem Myotubes Kultur13erstellen. Deshalb wollen wir prüfen, ob die Implantation von Post-Mortem-Muskel Gewebe geerntet in einen lebenden Wirt Muskelfaser Verlust umkehren wird. Wir entwickelten eine neuartige Technik namens MIME um Spender Muskelgewebe in Skelettmuskelgewebe eines lebenden Hosts einzupflanzen, um Spender Zelle abgeleitet Myogenesis zu fördern. MIME geht vorbei an einer chirurgischen Nadel durch den Host Muskel um eine Nadel Spur erstellen; zeichnen einen kleinen Ausschnitt des Spenders Muskelgewebe Durchgangsgleis Nadel; verlassen das Spendergewebe eingebettet in der Host-Muskel; und Schließen der Nadellöcher mit Gewebe-Klebeband. Nach dem Üben der Technik bei euthanasierten Mäusen untersucht in anderen Experimenten, wir haben jetzt MIME in live Mäuse, die immungeschwächt sind durchgeführt und ubiquitär express ein grünes fluoreszierendes Protein (GFP) und Follow-up bei 3 bis 14 Tagen Post-MIME. Bei 3 Tage Post-Pantomime bestätigen wir, dass Spender Maus (GFP)-EDL Muskel Host Maus (GLP +) TA Muskel, bleibt in der Host-Muskel eingebettet implantiert. Bei 14 Tagen Post-Pantomime bestätigen nach BaCl2 Myotoxin Verletzung, Schaden und Myogenesis, induzieren wir, dass ca. 5 %, 26 %, 26 % und 43 % der Fasern in einem einzigen Host TA Muskel keine Host Beitrag, minimale Host Beitrag, moderate Host zeigen Beitrag und maximaler Beitrag, bzw. veranstalten. Zentrales Keimbildung (ein Marker der Degeneration und anschließende Regeneration) sieht in etwa 95 % der Muskelfasern TA nach MIME und Myotoxin Injektion.
Wir studieren TA Muskeln 14 Tage nach MIME + BaCl2 , weil diesem Zeitpunkt die Zwischenstufe der Regeneration, fängt wenn eine Mehrheit der regenerierten Fasern sind zentral kernhaltigen. Wir studieren GFP + Mäuse als Gastgeber für Pantomime, damit wenn wir schließlich menschlichen cadaveric Muskel in Host-Mäuse Transplantation, wir leicht Muskelfasern Host und Spender Herkunft unterscheiden können. Wir verwenden Sie die Maus EDL Muskel als experimentelle Spendergewebe, da einzelne Fasern aus dieser Muskel größeres myogen Potenzial als TA Muskeln9gezeigt haben. Die EDL-Muskel ist auch synergistische an den TA-Muskel und hat ähnliche Fasertyp Zusammensetzung. Unsere vorläufigen Daten zufolge MIME Spender-abgeleitete Myogenesis in der Host-Muskel zu erleichtern vermag.
Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für die neuartige experimentelle Technik bekannt als MIME, in unserem Labor entwickelt, Spender Muskelgewebe in Host Muskelgewebe zu implantieren. Dies ist eine Adaption von einer offenen Muskel Pfropfung Technik, die bereits bewährt hat bei der Förderung von Spender-Zell-vermittelten Myogenesis in einem Host Muskel9,10,17.
Das Ziel von MIME ist nicht Engraftment des Spenders Muskelgewebes selbst in den Host-Muskel aktivieren (wir weiß derzeit nicht, wenn dies der Fall ist), sondern eine Quelle des Spenders SCs bieten, die Myogenesis in der Host-Muskel Bedingungen beitragen können, die stimulieren m Uscle Regeneration. Unsere Hoffnung ist, dass nach MIME wurde optimiert und getestet in Grund- und präklinischen Studien, es könnte liefern wertvolle Erkenntnisse führen Therapien zur Erhöhung der Muskelregeneration in der Skelettmuskulatur, die myogen Muskelabbau unterzogen wurden.
Es gibt zahlreiche Fragen, die noch nicht beantwortet werden, bezüglich wie MIME eine klinische Therapie, zum Beispiel übersetzt werden könnte: wie würden wir kontrollieren die Qualität von Spendergewebe? Wie würden wir Immunabwehr von Spendergewebe und Zellen kontrollieren? Erlischt das Spendergewebe nach Bereitstellung von Zellen für Myogenesis oder hinterlässt es eine fibrotische Narbe? Wirkt der Fasertyp Spender bzw. Gastgeber Muskel der Spender-Zell-vermittelten Myogenesis? Welche Muskeln können praktisch von MIME profitieren? Derzeit erweitern wir unsere Studien zu beurteilen, ob MIME sicher und wirksam ist, identifizieren Zusatztherapie Behandlungen, die können Spender abgeleitet Myogenesis zu erweitern, und viele der oben aufgeführten Fragen zu beantworten.
Nach Abschluss unserer Tests der Maus-Maus allogenen Transplantation mit MIME, ist unser nächster Schritt führen Sie Mensch-Maus-MIME mit cadaveric menschliches Gewebe um das myogen Potenzial von cadaveric Muskelgewebe zu bewerten. Wir gehen davon aus, dass diese Experimente zu einer neuen Linie von Grundlagen- und translationale Forschung führt die Muskelgewebe von Spendern, beinhaltet, die sich in Initiativen wie der Körper Vermächtnis für die Bildung und das Geschenk des Lebens-Programm für Organspende registriert sind .
Die repräsentativen Daten in dieser Handschrift legen nahe, dass 14 Tage nach MIME, gibt es einige brauchbare Myofibers, die entweder keine GFP oder niedrige GFP haben. Unsere Interpretation dieser Daten ist, dass die GFP-Spender Satellitenzellen, die Myogenesis in der Host-Muskel beigetragen. Wir haben dieses Experiment in der Vorbereitung für die Implantation von menschlichem cadaveric Gewebe in einen Host Maus Muskel durchgeführt. Um eindeutig zu demonstrieren, dass die Spenderzellen Satelliten zur Myogenesis in der Host-Muskel nach MIME beitragen, wäre es sinnvoll, Spendergewebe Implantat, das fluoreszierende Reporter, die von GFP (z. B.leicht unterschieden werden können drückt, rot fluoreszierenden Proteins mit dem Ausdruck Spendergewebe in GFP + Host Muskel implantiert).
Diese Technik wird vor allem durch die Art der SCs in das Spendergewebe vorhanden begrenzt. Wenn die SCs in das Spendergewebe lebensfähig, die Technik sind zu Spender-Zell-vermittelten Myogenesis erleichtern dürfte, zwar sind sie nicht lebensfähig, Myogenesis kann nicht auftreten. Jedoch da SCs sehr widerstandsfähig sind und für ca. 2 Wochen Post-Mortem lebensfähig sind, ist es sehr wahrscheinlich, dass das Spendergewebe, das innerhalb weniger Minuten nach der Ernte implantiert wird zu Versuchszwecken, Spender-Zell-vermittelten Myogenesis13 erleichtert . Zusätzlich, wie oben erwähnt, ist es möglich, die seit der ganze Muskelgewebe (das SCs, Reife Muskelfasern sowie Muskel-Resident Fibroblasten enthält) in den Host-Muskel eingebettet ist Fibrose auftreten könnte. Diese Annahme muss jedoch empirisch untersucht werden. Literatur über Muskelschäden, die von schädigenden Kontraktionen, Cryoinjury und experimentelle Myotoxins geht hervor, dass Immunzellen (hauptsächlich Makrophagen) in der Lage, effektiv clearing Zelltrümmer aus beschädigten Fasern und Umgestaltung der extrazelluläre Matrix18. Daher ist es möglich, dass nach MIME und BaCl2 Injektion, solange die Immunzellen Host Zugriff auf degenerierenden Spender Muskelfasern haben sie Trümmer, hinterließ nur der Spender SCs klar könnte. Schließlich ist das Ausmaß der Spender abgeleitet Myogenesis abhängig von der Menge an Spender Muskelgewebe, das in der Host-Muskel eingebettet ist. In Reihenfolge für die Host Muskel Fach vollständig von Spender-Zelle-derived Myofibers aufgefüllt werden müsste eine Methode wie X oder Gamma-Bestrahlung zu Host Muskel SCs abtragen und auch wiederholte MIME-Verfahren erfordern.
Es wurde nachgewiesen, dass chirurgisch Freilegung eines Host-Muskels und Nähen ein Stück Spendergewebe auf der Host-Muskel Spender-Zell-vermittelten Myogenesis9,10,17erleichtern können. Dieser offene chirurgische Ansatz hat in der Vergangenheit, das Fortschreiten der Myogenesis zu verfolgen und Maus-Modellen der menschlichen Muskelkrankheiten zu generieren verwendet worden. Der innovative Aspekt der MIME-Technik ist, dass es minimal invasiv ist und nicht chirurgisch Freilegung des Host-Muskels. Dies reduziert das Risiko der iatrogenen Infektion und dem Grad der Beschwerden in das Wirtstier, daher macht es mehr möglich, MIME wiederholt auf den gleichen Host Muskel durchgeführt, bei Bedarf.
Wir gehen davon aus, dass die MIME-Technik eine geeignete Verfeinerung auf dem offenen chirurgischen Ansatz sein könnte, das derzeit gefolgt wird, um das Implantat-Spender Muskelgewebe in eine Host-Maus. Dies könnte die Generation der humanisierte Mausmodelle, beschleunigen, indem Sie einbetten biopsierten menschlichen Muskel im Host Maus Muskel. Darüber hinaus erwarten basiert auf unseren vorläufigen Daten von Maus-Maus Pfropfen, wir, dass MIME wirksam bei der Erreichung von Spender-Zell-vermittelten Myogenesis von menschlichen cadaveric Spendergewebe solange Spender SCs sind lebensfähig sein wird. Zu guter Letzt mit zusätzlichen Tests und Validierung hoffen wir, dass die MIME-Technik hilft, Entwicklung neuer Therapien um Spender-Zell-vermittelten Myogenesis bei Menschen mit Muskelerkrankungen zu erleichtern.
Der Erfolg der MIME-Technik ist kritisch abhängig genau das Spendergewebe innerhalb der Faszien Fach (Epimysium) des Muskels Host einbetten. Nur wenn das Spendergewebe innerhalb der Host-Muskel-Fach befindet, werden SCs Gastgeber Muskel präzise anbieten. Wenn das Spendergewebe außerhalb der Host Muskel platziert wird, ist es unklar, was sein Schicksal sein würde. In unserem experimentellen Modell für MIME verwenden wir den TA-Muskel als Host Muskel, da es prominente und oberflächlich in den anterolateralen Aspekt des Beines ist. Größe, Ausrichtung und anatomische Position des TA-Muskels macht es einfach zu bestätigen, dass das Spendergewebe korrekt innerhalb der Host TA Muskel nach MIME sitzt. In diesem Papier haben wir experimentelle Beweise zur Verfügung gestellt, die das Spendergewebe reMains Host TA Muskel auf 3 Tage Post-MIME, und dass es eingebettet ist Spender-Zell-vermittelten Myogenesis im Muskel auf 14 Tage nach dem MIME-Host.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch einen Pilot-Zuschuss von der Allianz für Regenerative Rehabilitation Research (AR3T) und eine Fakultät für Startup-Paket von der Wayne State University zu JAR ermöglicht. AR3T wird von Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health und menschlichen Entwicklung (NICHD), National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall (NINDS) und National Institute of Biomedical Imaging und Bioengineering (NIBIB unterstützt. ) von den National Institutes of Health unter Nummer P2CHD086843 Award. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
NSG-GFP mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #021937 | Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein |
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #000664 | Control donor mice |
Tabletop isoflurane vaporizer | VetEquip (Livermore, CA) | Item #901801 | Inhaled anesthesia system |
Magic depilatory crea | Softsheen Carson (New York, NY) | N/A | Razorless hair removal cream |
4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures | Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD) | SUT106631 | Guiding sutures for donor tissue |
VetBond veterinary tissue adhesive | 3M (Maplewood, MN) | Catalog #1469Sb | Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure |
Barium chloride | Ricca Chemical Company (Arlington, TX) | Product #R0854000-500A 854-16 | Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration |
Deltaphase isothermal gel heating pad | Braintree Scientific (Braintree, MA) | Item #39DP | Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia |
HM525NX cryostat | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog #HM525NX | Cryostat to make frozen sections of muscle |
Vectashield Antifade Medium | Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) | Catalog Number: H-1000 | Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples |
Rabbit anti Desmin Antibody | Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA) | RB9014P | Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling |
Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog#: A-21069 | Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Seracare (Milford, MA) | Catalog #5930-0006 or 71-03-01 | Reagent for fluorescent labeling of nuclei |
Axio Scope.A1 microscope | Carl Zeiss (Peabody, MA) | Product #Axio Scope.A1 | Light and fluorescence microscope |
Photoshop CS4 | Adobe Systems (San Jose, CA) | Photoshop CS4 | Imaging Software for perform image tiling |
Image J | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | Image J for Windows 64-bit Operating System | Imaging Software for quantitative fluorescence analysis |