Her beskriver vi en metode til indlæsning af et kalciumfølsomt farvestof gennem frøens nervestub i nerveenderne. Vi præsenterer også en protokol til optagelse og analyse af hurtige calciumtransienter i perifere nerveender.
En af de mest gennemførlige metoder til måling af presynaptiske calciumniveauer i presynaptiske nerve terminaler er optisk optagelse. Den er baseret på brug af calciumfølsomme fluorescerende farvestoffer, der ændrer deres emissionsintensitet eller bølgelængde afhængigt af koncentrationen af frit calcium i cellen. Der findes flere metoder til at plette celler med calciumfarvestoffer. Mest almindelige er processerne til at indlæse farvestofferne gennem en mikropipette eller forinkubere med acetoxymethylesterformerne af farvestofferne. Disse metoder er imidlertid ikke helt gældende for neuromuskulære krydsninger (NMJ'er) på grund af metodologiske problemer, der opstår. I denne artikel præsenterer vi en metode til at indlæse et kalciumfølsomt farvestof gennem frøenes nervestub af frønerven i nerveenderne. Da indtrængen af eksternt calcium i nerve terminaler og den efterfølgende binding til calciumfarvestoffet forekommer inden for millisekundens tidsskala, er det nødvendigt at anvende et hurtigt billeddannelsessystem til registrering af disse interaktionerns. Her beskriver vi en protokol til optagelse af calciumtransienten med et hurtigt CCD kamera.
Calciumioner (Ca 2+ ) deltager i mange neuronale signalprocesser, herunder initiering, vedligeholdelse og plasticitet af mediatorfrigivelse 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Ved ankomsten af handlingspotentialet indtræder ekstracellulær Ca2 + i nerve-terminalen og initierer frigivelse af neurotransmitter. I nogle synapser kan calciumstrømmen måles direkte ved elektrofysiologiske metoder 6 , 7 , 8 . I tilfælde af det neuromuskulære kryds (NMJ) kan man ikke anvende direkte patch clamp og to-elektrode spænding clamp teknikker på grund af minut størrelse af nerveenderne.
Optagelser af indadgående Ca 2+ strømme fra nerveenderne i NMJ kan udføres ved indirekte elektrofyserIologiske metoder 9 , 10 . Imidlertid kræver disse fremgangsmåder forbehandling af synapset med natrium- og kaliumionkanalblokkere. Optiske metoder kræver ikke den farmakologiske adskillelse af ionstrømme i nerveterminalen og tillader optagelser af Ca 2+ tilstrømning, udløst af aktionspotentialer og den efterfølgende forhøjelse af Ca 2+ ioner i axoplasma 11 , 12 , 13 , 14 . Disse metoder er baseret på optagelser af ændringer i fluorescensen af specifikke Ca2 + -følsomme farvestoffer ved binding af frie Ca2 + -ioner 15 , 16 , 17 , 18 , 19 .
Ca 2+ indikatorer kan indlæses i cElls gennem en række forskellige metoder, afhængigt af formålet med eksperimentet. Forskere anvender badapplikationen af membran-permeable farvestofformer 20 , 21 , indlæsning via patchpipette 22 eller mikroinjektion 23 , 24 , 25 . Alle disse metoder har dog nogle begrænsninger i tilfælde af NMJ på grund af dets egenskaber i synaptisk arkitektonik. For NMJ er den mest hensigtsmæssige og vellykkede metode at indlæse farvestoffet gennem nervestubben, en fremfyldningsmetode 26 , 27 , 28 og 29 . Denne teknik kan anvendes til at ilægge forskellige fluorescensfarvestoffer ind i perifere nerveender. Denne metode blev med succes anvendt til Drosophila nerve terminaler 28 , firben motor nerve28 og frømotorens nerve terminaler 17 , 26 , 27 , 30 . Afhængig af objektet under undersøgelse kan metodiske detaljer variere. En glasmikro-pipette kan anvendes til små nerver fra larver 28 . Flere forskere har beskrevet en metode 27 , 28 , hvor en nyskåret ende af nerveinnovation af en muskel er nedsænket i en brønd, der er fyldt med et farvestof. Forberedelsen lades derefter i flere timer for at suge farvestoffet. Farvestoffet er gennemblødt af axonen og transporteret til nerve terminaler. I dette papir beskriver vi en metode til at indlæse en fluorescensindikator i frømotorens nerve terminaler gennem nervestubben. Vores protokol bruger en plastipipetip til inkubation af vævet med et farvestof. Vi beskriver også, hvordan man erhverver og analyserer Ca 2+ fluorescens transients.
I dette papir fremlagde vi metoden til at udføre Ca 2+ -følsom farvestofbelastning i frø-nerveender gennem nervestubben. Ved afslutning af indlæsningsproceduren har alle terminaler i den proximale del af nerve betydelige niveauer af fluorescens. Det er blevet estimeret, at sondens intra-terminale koncentration varierer mellem 40 og 150 μM 17 .
Inkubationsproceduren udføres i to trin: ved stuetemperatur og derefter ved en lavere temperatur i køleskab. Det er vigtigt at kontrollere tiden for vævsinkubation med farvestoffet ved stuetemperatur. Afhængigt af den faktiske længde af nervestubben, det specifikke farvestof og temperaturen kan inkubationstiden variere. Hvis overeksponeret, kan terminaler i de proximale dele tæt på nervestubben overbelastes. I midten af nerven er det dog stadig muligt at finde terminaler, der er tilfredsstillende indlæst. Under thEn lang inkubation i køleskabet, farvestoffet er jævnt fordelt over nerveenderne.
Vores egne observationer 33 , 35 samt data fra andre forskere 30 beviser manglen på nogen mærkbar indflydelse af indlæsningsproceduren på amplituden af det postsynaptiske respons eller på hyppigheden af miniature-endpladspotentialer. God levetid blev dokumenteret i de indlæste præparater. Der er nogle vigtige punkter, vi gerne vil henlede opmærksomheden på. Det er meget vigtigt at placere nervestubben i farvestofbelastningsopløsningen indenfor minutter efter udskæring for at gøre det muligt for farvestoffet at komme ind i axens afsnitsnerven. Forsinkelser kan forårsage ineffektive indlæsninger, formodentlig som følge af tilbagekoblingen af nerveaksoner 27 , 36 . Nogle efterforskere nedsænker nervestubben i 100 mM EDTA (en Ca 2+ – og Mg 2+ -chelator) Umiddelbart efter udskæring af nerveen for at forhindre udskårne axoner i at blive genindvundet. Bufferen fjernes efter 1-2 minutter og erstattes med en farvestof-opladningsløsning 37 . Brugen af en petroleumsgelbrønd i stedet for plastrør til indlæsningsproceduren tillader brugen af en kortere nervestub. Under anvendelse af denne fremgangsmåde skæres nerveren, efter at den er nedsænket i HEPES-opløsningen med farvestof, og axonerne forceller ikke på grund af manglen på divalente ioner i farvestofopløsningen 27 , 28 .
I vores undersøgelse anvendte vi den vandopløselige saltform af Ca 2+ -indikatoren i stedet for dextran. Dextrankonjugaterne diffunderer i aksonen langsommere end saltformerne. Anvendelsen af dextran-konjugatet reducerer imidlertid farveskomponentalisering og håndtering af nerve og NMJ'er. Calcium Green 1-3.000 MW dextran-konjugat har en god diffusionshastighed og demonstrerer reduceret compartmentalisering <s Up class = "xref"> 38.
Det er meget vigtigt at undgå en lang periode med fluorescerende belysning af vævet, fordi det påvirker dets helbred og overlevelse. Vi bruger Nomarski optik i den synlige lys kanal til at søge efter nerve terminaler. Under optagelsen begrænser vi det belyste felt ved hjælp af en membran.
Det er bemærkelsesværdigt, at denne indlæsningsmetode kun er egnet til præparater, der kan modstå lange inkubationer. For at reducere farvestofbelastningstiden, når der udføres undersøgelser på mere skrøbelige væv ( f.eks. Synapser af varmblodede dyr), er det nødvendigt at nedskalere nervestublængden og bruge mikropipetter til indlæsning 29 , 39 .
Denne belastningsteknik er velegnet til billeddannelsesændringer i cytosolisk Ca 2+ med fluorescerende indikatorer under både enkeltnervenstimulering og rytmisk synaptisk aktivitetEf "> 17 , 27 , 35. Analysen af Ca 2+ -transient amplitude kan bruges til at studere indflydelsen af forskellige stoffer på calciumindgangen, der deltager i neurotransmitterfrigivelse 33 .
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev udført under den russiske regerings program for konkurrencedygtig vækst i Kazan Federal University og et tilskud fra det russiske fundament for grundforskning (16-04-01051; 16-34-00817; 15-04-02983). Vi takker fire anonyme korrekturlæsere for at give nyttige kommentarer til tidligere udkast til manuskriptet. Vi udtrykker vores taknemmelighed til Yuliya Aratskaya til stemmeoptagelsen. Vi er taknemmelige for Dr. Victor Ilyin for de mange nyttige kommentarer og hjælpen med manuskriptets finale redigering.
Ca2+ indicator | Molecular Probes, USA | Oregon Green 488 BAPTA-1 hexapotassium salt, O6806 | 500 μg |
Silicone Elastomer | Dow Corning, USA | Sylgard 184 elastomer | |
Pipette | Biohit, Russia | 720210 | 0.5-10µL |
Pipette tip | Fisher Scientific, USA | 02-707-175 | 10µL |
Pipette tip | Biohit, Russia | 781349 | 10µL |
Razor Blade | Fisher Scientific, USA | 12-640 | |
Minutien Pins | Fine scince tools, Canada | 26002-20 | |
Corneal Mini-Scissors | MT MEDI CORP, Canada | S-1111 | |
Jeweler Forceps | MT MEDI CORP, Canada | F-9610 | |
Jeweler Forceps | MT MEDI CORP, Canada | F-9611 | |
Modelling clay | local producer | can be replaced by any local producer | |
Petroleum jelly | local producer | can be replaced by any local producer | |
Microspin FV 2400 | Biosan, Latva | BS-010201-AAA | |
Multi-spin MSC 3000 | Biosan, Latva | BS-010205-AAN | |
Single-use hypodermic needles | Bbraun | 100 Sterican | 0.4×40mm |
Syrynge | local producer | 0.5 ml | |
HEPES | Sigma-Aldrich, USA | H0887 | 100ml |
Microscope, BX51 | Olympus, Japan | ||
Stereomicroscope, Leica М80 | Leica Microsystems , Germany | ||
Illumination system Leica CLS 150Х | Leica Microsystems, Germany | ||
Data acquisition system | Molecular Devices, USA | Digitdata 1550 | |
software | Molecular Devices, USA | pClamp software, Version 10 | protocol can be download from : http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with. RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro |
Bath and bath temperature controler | Experimental Builder | can be replaced by any chamber with temperature control. For example from https://www.warneronline.com/ | |
Monochromator | Till Photonics, Germany | Polychrome V | no longer available, can be replaced by other sutable stable light source 488 nm |
monochromator control software | Till Photonics, Germany | Polycon | |
Digital CCD camera | Redshirt imaging, USA | Neuro CCD SMQ | |
Model 2100 Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems, USA | ||
Suction electrode | Kazakov, A. Prostoj vsasyvajushhij jelektrod dlja jelektricheskoj stimuljacii biologicheskih ob’ektov / M.Aleksandrov, N.V.Zhilyakov, E.F. Khaziev, D.V. Samigullin // Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. - 2015. – T. 40. – №9. – S. 13-16. | http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii- biologicheskix-obektov/ |
|
Acquisition software for CCD camera | Redshirt imaging, USA | Turbo SM software | |
ImageJ | National Institutes of Health, USA | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
Spreadsheet program | Microsoft, USA | Microsoft Office Excel |