JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurosciences

Chargement d'un colorant de calcium dans les terminaisons nerveuses de la grenouille à travers le souche nerveuse: Inscription transitoire de calcium dans la jonction neuromusculaire de la grenouille

Published: July 08, 2017
doi:
10.3791/55122
, , , ,
1Laboratory of Biophysics of Synaptic Processes, Kazan Scientific Centre, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics,Russian Academy of Sciences, 2Open Laboratory of Neuropharmacology,Kazan Federal University, 3Department of Radiophotonics and Microwave Technologies,A.N. Tupolev Kazan National Research Technical University, 4Department of Medical and Biological Physics,Kazan State Medical University

Summary

Ici, nous décrivons une méthode pour charger un colorant sensible au calcium à travers la souche du nerf de grenouille dans les terminaisons nerveuses. Nous présentons également un protocole pour l'enregistrement et l'analyse des transitoires de calcium rapides dans les terminaisons nerveuses périphériques.

Abstract

L'un des moyens les plus réalisables pour mesurer le taux de calcium présynaptique dans les terminaisons nerveuses présynaptiques est l'enregistrement optique. Il est basé sur l'utilisation de colorants fluorescents sensibles au calcium qui modifient leur intensité d'émission ou leur longueur d'onde en fonction de la concentration de calcium libre dans la cellule. Il existe plusieurs méthodes pour tacher les cellules avec des colorants au calcium. Les procédés de chargement des colorants sont les plus courants dans une micropipette ou pré-incubés avec les formes d'acétoxyméthyl ester des colorants. Cependant, ces méthodes ne sont pas tout à fait applicables aux jonctions neuromusculaires (NMJ) en raison de problèmes méthodologiques qui surviennent. Dans cet article, nous présentons une méthode pour charger un colorant sensible au calcium à travers le moignon nerveux de la grenouille du nerf de la grenouille dans les terminaisons nerveuses. Puisque l'entrée de calcium externe dans les terminaux nerveux et la liaison subséquente au colorant au calcium se produisent dans l'intervalle de millisecondes, il est nécessaire d'utiliser un système d'imagerie rapide pour enregistrer ces interactionsNs. Ici, nous décrivons un protocole pour enregistrer le transitoire de calcium avec une caméra CCD rapide.

Introduction

Les ions de calcium (Ca 2+ ) participent à de nombreux processus de signalisation neuronale, y compris l'initiation, la maintenance et la plasticité de la libération 1 , 2 , 3 , 4 , 5 du médiateur. À l'arrivée du potentiel d'action, le Ca 2+ extracellulaire entre dans la borne nerveuse et déclenche la libération du neurotransmetteur. Dans certaines synapses, le courant de calcium peut être mesuré directement par des méthodes électrophysiologiques 6 , 7 , 8 . Dans le cas de la jonction neuromusculaire (NMJ), on ne peut pas utiliser des pinces à patch direct et des techniques de serrage par tension à deux électrodes en raison de la taille minimale des terminaisons nerveuses.

Les enregistrements des courants internes de Ca 2+ des terminaisons nerveuses dans le NMJ peuvent être effectués par électrophyses indirectesMéthodes physiologiques 9 , 10 . Cependant, ces méthodes nécessitent le prétraitement de la synapse par les bloqueurs des canaux ioniques et de potassium. Les méthodes optiques ne nécessitent pas la séparation pharmacologique des courants ioniques dans la borne nerveuse et permettent des enregistrements d'afflux de Ca 2+ , déclenchés par des potentiels d'action et l'élévation subséquente des ions Ca 2+ dans les axoplasmes 11 , 12 , 13 , 14 . Ces méthodes sont basées sur des enregistrements des modifications de la fluorescence de colorants sensibles au Ca 2 + sur la liaison des ions Ca 2+ libres 15 , 16 , 17 , 18 , 19 .

Les indicateurs Ca 2+ peuvent être chargés dans le cUtilise une variété de méthodes, selon le but de l'expérience. Les chercheurs utilisent l'application de bain de formes de colorant perméables à la membrane 20 , 21 , le chargement par pipette 22 ou la micro-injection 23 , 24 , 25 . Cependant, toutes ces méthodes ont certaines limitations dans le cas du NMJ en raison de ses particularités dans l'architecture architecturale synaptique. Pour le NMJ, la méthode la plus pratique et la plus réussie est de charger le colorant à travers le moignon nerveux, une méthode de remplissage vers l'avant 26 , 27 , 28 , 29 . Cette technique peut être utilisée pour charger différents colorants de fluorescence dans les terminaisons nerveuses périphériques. Cette méthode a été utilisée avec succès pour les terminaisons nerveuses Drosophila 28 , le nerf moteur lézard28 , et les terminaux nerveux moteur de la grenouille 17 , 26 , 27 , 30 . Selon l'objet à l'étude, les détails méthodiques peuvent varier. Une micro-pipette en verre peut être utilisée pour les petits nerfs des larves 28 . Plusieurs chercheurs ont décrit une méthode 27 , 28 dans laquelle une extrémité fraîchement coupée de nerf innervant un muscle est immergée dans un puit pré-rempli d'un colorant. La préparation est ensuite laissée pendant plusieurs heures pour tremper le colorant. Le colorant est trempé par les axones et transporté vers les bornes nerveuses. Dans cet article, nous décrivons une méthode de chargement d'un indicateur de fluorescence dans les terminaisons nerveuses motrices à travers le moignon nerveux. Notre protocole utilise une pointe de pipette en plastique pour l'incubation du tissu avec un colorant. Nous décrivons également comment acquérir et analyser le fluorescence Ca 2+Nsients.

Protocol

Des expériences ont été réalisées sur des préparations isolées de muscles nerveux du poitrine cutanée musculaire de la grenouille Rana ridibunda . La taille des animaux des deux sexes était d'environ 5-9 cm. Les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux lignes directrices pour l'utilisation d'animaux de laboratoire de l'Université fédérale de Kazan et de l'Université médicale de Kazan, conformément au Guide NIH pour la prise en charge et l'utilisation des animaux de laboratoire. Le protocole expérimental répond aux exigences de la directive 86/609 / CEE du Conseil des Communautés européennes et a été approuvé par le Comité d'éthique de l'Université médicale de Kazan. 1. Préparation des solutions Préparation de la solution de Ringer. Préparer la solution de Ringer: 113,0 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 3,0 mM de NaHC03 et 1,8 mM de CaCl2. Ajuster le pH à 7.2-7.4. Préparez la solution de Ringer avec un faible Ca 2+ </Sup> et une teneur élevée en Mg 2+ : 113,0 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 3,0 mM de NaHC03, 6,0 mM de MgCl2, 0,9 mM de CaCl2. Ajuster le pH à 7.2-7.4. Préparation de la solution de charge de colorant. Préparez la solution à base d'eau contenant du HEPES-Na à 10 mM (pH 7,2-7,4). Ajouter 14 μL de la solution HEPES dans un flacon avec le colorant 30 . REMARQUE: le colorant indicateur Ca 2+ se trouve dans un flacon de 500 μL avec 500 μg de poudre. Vortex et tourne vers le bas pour bien mélanger. Diluer la solution pour ramener la concentration finale de l'indicateur de Ca 2 + à 30 mM. Éviter l'exposition à la lumière et conserver à -20 ° C. 2. Procédure de chargement de teinture Dissection du muscle de la peau cutanée avec un morceau du nerf pectoral proprius . REMARQUE: la procédure de dissection est disponibleDans un téléchargement gratuit du document de Blioch et al. , 1968 31 . Pour la procédure de dissection, utilisez deux pinces fines et des ciseaux cornéens (voir la Table des matériaux ). Transférer le tissu disséqué dans une boîte de Pétri en silicone recouvert d'élastomère pré-rempli avec la solution de Ringer et fixer le tissu avec de fines épingles en acier inoxydable de manière à ce qu'il soit légèrement étiré dans le plat. Remplir la boîte de Petri avec une partie aliquote fraîche de la solution de Ringer. Retirer les tissus conjonctifs. Ne pas endommager le nerf. Préparez la pipette de remplissage: à l'aide d'une lame de rasoir, découpez un morceau de 2 mm de long de la partie conique d'une pointe de pipette en plastique standard de 10 μL. Préparez un morceau d'argile de modélisation pour monter la pipette de remplissage sur la boîte de Petri. Raccorder l'arrière de la pipette de remplissage à une seringue en plastique via des tubes en silicone et des adaptateurs de connexion en plastique fabriqués à partir de pointes à pipettes. Avant le dProcédure de chargement, retirez la solution de Ringer de la boîte de Petri à l'aide d'une pipette en plastique. Sécher la préparation du nerf musculaire en utilisant une seringue fine; Cela empêchera la dilution du colorant Ca 2 + lors du chargement ultérieur de la pipette de remplissage. Retirez le flacon indicateur Ca 2+ du congélateur et laissez-le dégager à température ambiante dans un endroit sombre. Sous le contrôle du stéréomicroscope avec un faible grossissement (10 ×), détecter la jonction entre le muscle et le nerf. Avec des pinces fines et des ciseaux, couper le nerf pectoral proprius près de la surface musculaire (voir étape 2.1). Laissez une souche nerveuse d'environ 2 mm de long. Fixez la pipette de remplissage attachée au tube et la seringue sur la boîte de Petri à l'aide d'une argile de modélisation. Déplacez la pointe de la pipette près de la moelle nerveuse. Sans le pincer, aspirer délicatement la moelle du nerf dans la pointe de la pipette de remplissage. Retirer le tube d'aspiration du blunT fin de la pipette de remplissage. Retirez soigneusement la solution excédentaire de la pipette de remplissage à l'aide d'une seringue à aiguille longue (voir la Table des matériaux ). Ne pas pincer le moignon nerveux. Élevez verticalement la pointe de la pipette de remplissage légèrement, en gardant le moignon nerveux aspiré dans la pointe. Isoler la partie aspirée de la moelle nerveuse de l'extérieur de la pointe de la pipette de remplissage en utilisant de la vaseline. Sécher la souche nerveuse isolée dans la pipette de remplissage si nécessaire: aspirer doucement l'excès de solution de la pipette de remplissage à l'aide d'une seringue à aiguille longue. Dessinez 0,5 μL de la solution de charge de colorant (voir étape 1) à l'aide d'une pipette à pointe longue de pipette. Insérez délicatement la pointe de la pipette avec la solution de chargement dans la pipette de remplissage. Éjecter le mélange directement sur le moignon nerveux. Sceller l'extrémité ouverte de la pipette de remplissage avec de la vaseline. Ajouter une petite partie de Ringer's sOlution à la boîte de Petri pour garder la préparation humide. Incuber la préparation à température ambiante dans des conditions sombres et humides pendant 5 h. Retirez la pipette de remplissage avec une solution de chargement, rincez la préparation avec la solution de Ringer et gardez la nuit au réfrigérateur à 8 ° C. 3. Préparation du tissu pour la microscopie Monter la préparation dans la chambre revêtue d'élastomère au silicium et la fixer avec des micro-aiguilles en acier de sorte qu'elle soit légèrement étirée. Rincer le tissu avec une partie de la solution fraîche de Ringer. Utilisez une électrode d'aspiration pour stimuler le nerf; La construction de l'électrode est disponible à partir du téléchargement gratuit du document par Kazakov et al. , 2015 32 . Placez la pointe de l'électrode à proximité de l'extrémité découpée du nerf et suivez la souche nerveuse dans l'orifice de l'électrode. Monter la chambre de préparation à l'étape du microscope. PlacE la sonde de température et les tirs d'entrée et de sortie dans la chambre. Connectez le cordon d'alimentation à l'élément Peltier. Pour superposer la préparation, utilisez un système simple axé sur la gravité. Pour enlever la solution excédentaire, allumez la pompe d'aspiration de perfusion. Allumez l'unité de contrôleur thermique. Réglez le contrôle de la température à 20 ° C. Monter le bouclier de protection ultraviolet. Raccorder l'électrode de fil de stimulation au stimulateur électrique et observer les contractions musculaires sous microscope avec un objectif 4x. Remplissez le système de perfusion avec la solution de Ringer avec un faible teneur en Ca 2+ et haute teneur en Mg 2+ . NOTE: Cette solution est utilisée pour prévenir les contractions musculaires. Une diminution de la concentration de calcium externe et une élévation du magnésium externe entraînent une réduction de l'amplitude des transitoires de Ca 2+. Cependant, selon l'expérience antérieure, CaCl 0,9 mM <sub> 2 et 6 mM de MgCl 2 sont encore suffisants pour résoudre de manière fiable l'amplitude des transitoires de Ca 2+ . Il convient de mentionner qu'il existe d'autres façons de diminuer les contractions musculaires sans réduire la concentration de Ca 2+. Par exemple, l'utilisation de la d-tubocurarine ou de l'alpha-bungarotoxine, des bloqueurs spécifiques des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine, bloquerait totalement ou partiellement les contractions musculaires 17 , 27 , 28 , 30. Cependant, l'addition de ces toxines peut également affecter l'entrée présynaptique du calcium 33 . Pour éviter cela, μ-conotoxin GIIIA peut être utilisé 27 . Allumez la pompe et commencez la superfusion de la préparation avec la solution Ringer avec un faible Ca 2+ et un haut Mg 2+ . Passez à l'objectif 40 × au microscope. Allumer t Il monochromateur (voir le tableau des matériaux ). Sélectionnez une longueur d'onde d'émission de 488 nm et un mode d'éclairage continu dans le logiciel de contrôle du monochromateur. Sous un grand grossissement en mode fluorescence, assurez-vous que les bornes nerveuses ont été chargées avec le colorant. Figure 1 : Nerveur et bornes avec indicateur de Ca 2+ chargé. ( A ) Nerveuse remplie d'indicateur de Ca 2 + après la procédure de chargement. Barre d'échelle = 200 μm. ( B ) Finitions nerveuses remplies d'indicateur Ca 2+ . Barre d'échelle = 20 μm. ( C ) La fluorescence de Ca 2+ -indicateur est clairement visible dans la terminaison nerveuse. Barre d'échelle = 20 μm._blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Laisser la préparation équilibrée pendant au moins 30 minutes dans la solution à faible teneur en Ca 2+ et à haute teneur en Mg 2+ . 4. Capture vidéo avec la caméra numérique CCD Remarque: Les détails de la capture des signaux de fluorescence sont spécifiques pour chaque microscope et type de caméra, mais la clé est la vitesse de capture d'image. Utilisez 1 kHz comme fréquence de capture minimale pour les enregistrements de transitoires de Ca 2+ dans le NMJ. REMARQUE: les caméras CCD numériques rapides sont nécessaires pour l'imagerie par fluorescence (voir la table des matières ). Le système et le logiciel d'acquisition de données (voir la Table des matières ) ont été utilisés ici pour la synchronisation de la caméra, du monochromateur et du stimulateur. En bref, ce protocole permet la génération d'impulsions de synchronisation sur les sorties numériques des donnéesSystème d'acquisition pour ouvrir l'obturateur, capturer le signal vidéo et initier la stimulation. Tous les paramètres temporels peuvent être définis dans les protocoles et / ou sur les appareils. Un protocole typique est une série de 500 images acquises à 1 kHz (80 x 80 pixels). L'éclairage avec la lumière d'excitation peut blanchir l'indicateur de Ca 2+ et photodamater le tissu cellulaire. Ainsi, évitez les longues expositions à la lumière d'excitation. Dans ce protocole, l'obturateur est ouvert uniquement pour le temps nécessaire pour capturer la vidéo. Acquérir vingt séries par terminal nerveux spécifique. L'objectif ici est de surveiller les mêmes sites dans le groupe témoin et après la délivrance du médicament. Sous l'objectif 4X objectif d'un microscope, utilisez le régime de champs lumineux pour visualiser les branches musculaires et nerveuses. Passez à l'objectif 40X et, en utilisant le régime d'épifluorescence et une longueur d'onde d'excitation de 488 nm, recherchez les terminaisons nerveuses chargées de colorant. Identifiez une région d'interférence nerveuse. Sur le tube trinoculaire oPour le microscope, sélectionnez les niveaux d'échange du chemin lumineux: 100% de lumière sur caméra. Démarrez le logiciel d'acquisition pour la caméra CCD. Sous le mode "Live", trouvez le ROI et ajustez la mise au point. Sélectionnez le menu "Changer" les paramètres. Utilisez la "Configuration de base" à 1000 images par seconde (fps), avec une résolution de 80 x 80. Réglez le nombre de trames d'entrée sur 500. Entrez le nom de l'expérience. Choisissez "Disjoncteur externe". Réglez le temps de pré-déclenchement à 10 ms. Réglez le nombre de répétitions à 20. Dans le logiciel de contrôle du monochromateur, sélectionnez une longueur d'onde d'émission de 488 nm et un mode "éclairage de déclenchement externe". Exécutez le logiciel d'acquisition de données. Chargez le protocole de stimulation. Avant d'enregistrer la vidéo, capturez le cadre sombre à l'aide du logiciel d'acquisition vidéo. Exécutez le protocole de stimulation. Sélectionnez le ROI et checK le signal enregistré. 5. Analyse des données NoOTE: Pour l'analyse des données, utilisez le logiciel de caméra CCD et ImageJ; Les données sont représentées par une courbe dans une feuille de calcul. Dans le logiciel de caméra CCD, 20 répètent en moyenne et exportent les résultats vers un fichier de support ImageJ. Dans ImageJ, sélectionnez le ROI et l'arrière-plan. Soustraire l'arrière-plan du ROI. Représentez les données en tant que rapport: (ΔF / F 0 -1) x 100%, où ΔF est l'intensité de la fluorescence pendant la stimulation et F 0 est l'intensité de la fluorescence au repos. Dans le logiciel d'acquisition de la caméra CCD, cliquez sur Fichier> Fichiers moyens. Sélectionnez les fichiers et les moyenne. Enregistrez le fichier moyen en tant que fichier .fit en cliquant sur "Enregistrer le fichier Fit". Exécutez le logiciel ImageJ. Effectuez les étapes suivantes: Cliquez sur Image> régler> luminosité / contraste. Cliquez sur Image> piles> outils>; Trieur de pile. Cliquez sur Analyse> outils> Gestionnaire de ROI. Faites glisser et déposez le fichier .fit en moyenne dans la fenêtre ImageJ. Accédez à la fenêtre pour une meilleure vue. En déplaçant le curseur, sélectionnez le dernier cadre et supprimez-le (c'est le cadre sombre) Sélectionnez un ROI rectangulaire sur la zone censée être l'arrière-plan. Ajoutez-le au gestionnaire de ROI Mesurez l'arrière-plan en cliquant sur Plus> Multi Mesure. Notez le MEAN. Copiez les données, exportez-la à une feuille de calcul et calculez la valeur moyenne du seuil pour un ratio. Soustrayez le seuil des piles en cliquant sur Process> Main> Soustraire. Entrez la valeur moyenne du seuil. Sélectionnez un ROI rectangulaire autour d'une borne nerveuse. Ajoutez-le au gestionnaire de ROI. Mesurez en cliquant sur Plus> Multi Mesure. Notez le MEAN. Copiez-le et expédiez-le à une feuille de calcul. Moyenne du décalage des signaux. REMARQUE: utilisez lePremière dizaine de points démontrant la fluorescence des colorants de base sans stimulation; C'est la fluorescence au repos. Divisez les signaux par la fluorescence au repos. Soustraire "1" et multiplier par 100%. Tracer le signal et calculer l'amplitude du transitoire Ca 2+ .

Representative Results

Après le chargement du colorant et sur la stimulation nerveuse motrice, une augmentation de l'amplitude du signal fluorescent (Ca 2+ transitoire) peut être détectée dans les bornes nerveuses (voir Figure 2 ). Les paramètres des transitoires de Ca 2+ sont présentés dans le tableau 1 . Quantitativement, les paramètres des transitoires de Ca 2+ mesurés dans notre étude sont proches des données obtenues par d'autres scientifiques lors de synapses d'animaux à sang froid 15 , 34 . Les paramètres des transitoires de Ca 2+ dépendent du taux de liaison de Ca 2+ avec le colorant et de la dissociation subséquente. Le taux d'entrée de Ca 2 + dans la terminaison nerveuse, l'interaction avec le colorant et la diffusion dans le cytoplasme affectent tous le temps de montée du transitoire Ca 2+ . Le temps de désintégration du signal fluorescent dépend de l'affinité du colorant,La vitesse de l'interaction Ca 2+ avec les tampons intracellulaires et l'élimination par les pompes à ion 35 . L'analyse d'amplitude des transitoires de Ca 2+ peut être utilisée pour étudier l'influence de diverses substances sur l'entrée de calcium qui participe à la délivrance de neurotransmetteurs 33 . Figure 2 : Le Ca 2+ moyen Transitoire mesuré dans la grenouille NMJ. Le transitoire de Ca 2+ a été calculé en fonction de la moyenne des signaux provenant de 13 NMJ de grenouille. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. De pointeΔF / F (%) Temps de montée 20% -80% (ms) Τ (ms) 12,6 ± 1,1 (n = 13) 4,6 ± 0,5 (n = 13) 115,3 ± 8,3 (n = 13) Tableau 1: Paramètres moyennés du transitoire Ca 2+ . Les données sont présentées comme la moyenne ± SE; N est le nombre de mesures dans des NMJ distincts. Le pic ΔF / F est l'amplitude moyenne de ΔF / F.

Discussion

Dans cet article, nous avons présenté la méthode d'exécution de la charge de colorant sensible au Ca 2 + dans les terminaisons nerveuses de la grenouille à travers le moignon nerveux. À la fin de la procédure de chargement, tous les terminaux de la partie proximale du nerf ont des niveaux significatifs de fluorescence. On a estimé que la concentration intra-terminale de la sonde varie entre 40 et 150 μM 17 .

La procédure d'incubation se déroule en deux étapes: à température ambiante, puis à une température inférieure au réfrigérateur. Il est important de contrôler le temps d'incubation tissulaire avec le colorant à température ambiante. En fonction de la longueur réelle du moignon nerveux, du colorant spécifique et de la température, le temps d'incubation peut varier. En cas de surexposition, les bornes dans les parties proximales proches de la moelle nerveuse peuvent être surchargées. Cependant, dans le milieu du nerf, il est encore possible de trouver des terminaux chargés de manière satisfaisante. Au cours dePendant une longue incubation au réfrigérateur, le colorant est uniformément réparti sur les terminaisons nerveuses.

Nos propres observations 33 , 35 , ainsi que les données d'autres chercheurs 30 , prouvent l'absence d'influence appréciable de la procédure de chargement sur l'amplitude de la réponse post-synaptique ou sur la fréquence des potentiels miniatures de la plaque d'extrémité. Une bonne longévité a été documentée dans les préparations chargées. Il y a des points importants sur lesquels nous aimerions attirer l'attention. Il est très essentiel de placer la souche du nerf dans la solution de charge de colorant dans quelques minutes seulement après l'excision pour permettre au colorant d'entrer dans les axones du nerf coupé; Les retards peuvent provoquer un chargement inefficace, probablement en raison du resserrement des axones nerveux 27 , 36 . Certains chercheurs immergent la moelle nerveuse dans 100 mM EDTA (un Ca 2+ et Mg 2 + -chelator) Immédiatement après l'excision du nerf pour empêcher les axones coupés de se refermer. Le tampon est éliminé après 1-2 min et remplacé par une solution de charge de colorant 37 . L'utilisation d'un puits de gelée de pétrole au lieu de tubes en plastique pour la procédure de chargement permet l'utilisation d'un moignon nerveux plus court. En utilisant cette approche, le nerf est coupé après avoir été immergé dans la solution HEPES avec du colorant et les axones ne se referment pas en raison du manque d'ions divalents dans la solution de colorant 27 , 28 .

Dans notre étude, nous avons utilisé la forme de sel hydrosoluble de l'indicateur de Ca 2+ au lieu du dextrane. Les conjugués de dextrane diffusent dans l'axone plus lentement que les formes de sel. Cependant, l'utilisation du conjugué de dextrane réduit la compartimentation et la manipulation des colorants par le nerf et les NMJ. Calcium Green Le conjugué de dextrane de 1-3 000 MW a un bon taux de diffusion et démontre une compartimentation réduite <s Up class = "xref"> 38.

Il est très important d'éviter une longue période d'illumination fluorescente du tissu, car cela affecte sa santé et sa survie. Nous utilisons l'optique Nomarski dans le canal de lumière visible pour rechercher des terminaux nerveux. Pendant l'enregistrement, nous limitons le champ éclairé à l'aide d'un diaphragme.

Il est à noter que cette méthode de chargement convient uniquement aux préparations pouvant résister à de longues incubations. Pour réduire le temps de chargement de teinture lorsque des études sont menées sur des tissus plus fragiles ( p. Ex., Synapses d'animaux à sang chaud), il faut diminuer la longueur de la moelle épinière et utiliser des micropipettes pour le chargement 29 , 39 .

Cette technique de chargement est bien adaptée aux changements d'imagerie dans le Ca 2+ cytosolique, avec des indicateurs fluorescents à la fois à la stimulation à un seul nerf et à l'activité synaptique rythmiqueEffet> 17 , 27 , 35. L'analyse de l'amplitude transitoire Ca 2+ peut être utilisée pour étudier l'influence de différentes substances sur l'entrée de calcium qui participe à la libération de neurotransmetteurs 33 .

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été réalisée dans le cadre du programme du gouvernement russe pour la croissance concurrentielle de l'Université fédérale de Kazan et une subvention de la Fondation russe pour la recherche fondamentale (16-04-01051; 16-34-00817; 15-04-02983). Nous remercions quatre examinateurs anonymes d'avoir fourni des commentaires utiles sur les versions préliminaires du manuscrit. Nous exprimons notre gratitude à Yuliya Aratskaya pour l'enregistrement vocal. Nous remercions le Dr Victor Ilyin pour les nombreux commentaires utiles et l'aide pour l'édition finale du manuscrit.

Materials

Ca2+ indicator Molecular Probes, USA Oregon Green 488 BAPTA-1 hexapotassium salt, O6806 500 μg
Silicone Elastomer Dow Corning, USA Sylgard 184 elastomer
Pipette Biohit, Russia 720210 0.5-10µL
Pipette tip Fisher Scientific, USA 02-707-175 10µL
Pipette tip Biohit, Russia 781349 10µL
Razor Blade Fisher Scientific, USA 12-640
Minutien Pins Fine scince tools, Canada 26002-20
Corneal Mini-Scissors MT MEDI CORP, Canada S-1111
Jeweler Forceps MT MEDI CORP, Canada F-9610
Jeweler Forceps MT MEDI CORP, Canada F-9611
Modelling clay local producer can be replaced by any local producer
Petroleum jelly local producer can be replaced by any local producer
Microspin FV 2400  Biosan, Latva BS-010201-AAA
Multi-spin MSC 3000 Biosan, Latva BS-010205-AAN
Single-use hypodermic needles Bbraun 100 Sterican 0.4×40mm
Syrynge local producer 0.5 ml
HEPES  Sigma-Aldrich, USA H0887 100ml
Microscope, BX51 Olympus, Japan
Stereomicroscope, Leica М80 Leica Microsystems , Germany 
Illumination system Leica CLS 150Х  Leica Microsystems, Germany 
Data acquisition system  Molecular Devices, USA Digitdata 1550
software Molecular Devices, USA pClamp software, Version 10 protocol can be download from : http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with.
RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro
Bath and bath temperature controler Experimental Builder can be replaced by any chamber with temperature control. For example from https://www.warneronline.com/ 
Monochromator Till Photonics, Germany Polychrome V no longer available, can be replaced by other   sutable stable light source 488 nm
monochromator control software Till Photonics, Germany Polycon
Digital CCD camera Redshirt imaging, USA Neuro CCD SMQ
Model 2100 Isolated Pulse Stimulator A-M Systems, USA
Suction electrode Kazakov, A. Prostoj vsasyvajushhij jelektrod dlja jelektricheskoj stimuljacii biologicheskih ob’ektov / M.Aleksandrov, N.V.Zhilyakov, E.F. Khaziev, D.V. Samigullin // Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. -  2015. – T. 40. – №9. – S. 13-16. http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-
biologicheskix-obektov/
Acquisition software for CCD camera Redshirt imaging, USA Turbo SM software
ImageJ National Institutes of Health, USA http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Spreadsheet program Microsoft, USA Microsoft Office Excel 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Llinás, R., Sugimori, M., Silver, R. B. Microdomains of high calcium concentration in a presynaptic terminal. Science. 256, 677-679 (1992).
  2. Augustine, G. J. How does calcium trigger neurotransmitter release?. Curr Opin Neurobiol. 11, 320-326 (2001).
  3. Burnashev, N., Rozov, A. Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy. Cell Calcium. 37, 489-495 (2005).
  4. Schneggenburger, R., Neher, E. Presynaptic calcium and control of vesicle fusion. Curr Opin Neurobiol. 15, 266-274 (2005).
  5. Pang, Z. P., Südhof, T. C. Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis. Curr Opin Cell Biol. 22, 496-505 (2010).
  6. Borst, J. G., Sakmann, B. Calcium influx and transmitter release in a fast CNS synapse. Nature. 383, 431-434 (1996).
  7. Borst, J. G., Sakmann, B. Calcium current during a single action potential in a large presynaptic terminal of the rat brainstem. J Physiol. 506, 143-157 (1998).
  8. Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses. J Neurosci. 17, 2990-3001 (1997).
  9. Molgó, J., Mallart, A. Effects of Anemonia sulcatatoxin II on presynaptic currents and evoked transmitter release at neuromuscular junctions of the mouse. Pflugers Arch. 405 (4), 349-353 (1985).
  10. Slutsky, I., Rashkovan, G., Parnas, H., Parnas, I. Ca2+-independent feedback inhibition of acetylcholine release in frog neuromuscular junction. J Neurosci. 22 (9), 3426-3433 (2002).
  11. Haugland, R. P., Gregory, J. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. Handbook of fluorescent probes and research products. , 771-826 (2002).
  12. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  13. Tsien, R. Y. Fluorescent indicators of ion concentrations. Methods Cell Biol. 30, 127-156 (1989).
  14. Adams, S. R. How calcium indicators work. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (3), (2010).
  15. DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction. J Physiol. 505, 585-592 (1997).
  16. Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Optical measurement of presynaptic calcium currents. Biophys J. 74, 1549-1563 (1998).
  17. Suzuki, S. Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal. Pflug Arch Eur J Phisiol. 440, 351-365 (2000).
  18. Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. The life cycle of Ca2+ ions in dendritic spines. Neuron. 33, 439-452 (2002).
  19. Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. Single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals. J Neurosci. 31, 11268-11281 (2011).
  20. Regehr, W. G., Yuste, R., Konnerth, A. Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators. Imaging in neuroscience and development: a laboratory manual. , 307-314 (2005).
  21. Macleod, G. T. Topical Application of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 786-790 (2012).
  22. Eilers, J., Konnerth, A. Dye loading with Patch Pipettes. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (4), 277-281 (2009).
  23. Coleman, W. L., Bill, C. A., Simsek-Duran, F., Lonart, G., Samigullin, D., Bykhovskaia, M. Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals. J Physiol. 586 (19), 4649-4673 (2008).
  24. Macleod, G. T. Direct Injection of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 797-801 (2012).
  25. Talbot, J. D., David, G., Barrett, E. F., Barrett, J. N. Calcium dependence of damage to mouse motor nerve terminals following oxygen/glucose deprivation. Exp Neurol. 234 (1), 95-104 (2012).
  26. Peng, Y. Y., Zucker, R. S. Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca2+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia. Neuron. 10, 465-473 (1993).
  27. Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. alpha-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals. J Neurosci. 20 (23), 8685-8692 (2000).
  28. Newman, Z., Malik, P., Wu, T. Y., Ochoa, C., Watsa, N., Lindgren, C. Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction. Eur J Neurosci. 25 (6), 1619-1630 (2007).
  29. Macleod, G. T. Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 3440-3450 (2012).
  30. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  31. Blioch, Z. L., Glagoleva, I. M., Liberman, E. A., Nenashev, V. A. A study of the mechanism of quantal transmitter release at a chemical synapse. J Physiol. (1), 11-35 (1968).
  32. Kazakov, A., Aleksandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects. Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel’skij zhurnal. 40 (9), 13-16 (2015).
  33. Khaziev, E. Acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction. Front Physiol. 7 (621), 1-10 (2016).
  34. Bélair, E. L., Vallée, J., Robitaille, R. Long-term in vivo modulation of synaptic efficacy at the neuromuscular junction of Rana pipiens frogs. J Physiol. 569 (1), 163-178 (2005).
  35. Samigullin, D., Fatikhov, N., Khaziev, E., Skorinkin, A., Nikolsky, E., Bukharaeva, E. Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes. Front Synaptic Neurosci. 6 (29), 1-10 (2015).
  36. Angleson, J. K., Betz, W. J. Intraterminal Ca2+ and spontaneous transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Neurophysiol. 85 (1), 287-294 (2001).
  37. Shahrezaei, V., Cao, A., Delaney, K. R. Ca2+ from one or two channels controls fusion of a single vesicle at the frog neuromuscular junction. J Neurosci. 26 (51), 13240-132499 (2006).
  38. Troncone, L. R., et al. Promiscuous and reversible blocker of presynaptic calcium channels in frog and crayfish neuromuscular junctions from Phoneutria nigriventer spider venom. J Neurophysiol. 90 (5), 3529-3537 (2003).
  39. Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Sudakov, I. A., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction. BioNanoSci. 7 (1), 162-166 (2016).

Tags

Calcium DyeFrog Nerve EndingsNeuromuscular JunctionOptical RecordingCalcium TransientCalcium SignalingHEPESOregon Green BAPTARinger’s SolutionNerve StumpNerve EndingsMuscle Preparation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (125), e55122, doi:10.3791/55122 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image