Aquí, describimos un método para cargar un colorante sensible al calcio a través del tocón del nervio de la rana en las terminaciones nerviosas. También presentamos un protocolo para el registro y el análisis rápido de los transitorios de calcio en las terminaciones nerviosas periféricas.
Uno de los métodos más factibles de medir los niveles de calcio presináptico en las terminales nerviosas presinápticas es la grabación óptica. Se basa en el uso de colorantes fluorescentes sensibles al calcio que cambian su intensidad de emisión o longitud de onda dependiendo de la concentración de calcio libre en la célula. Hay varios métodos utilizados para teñir las células con tintes de calcio. Los más comunes son los procesos de carga de los colorantes a través de una micropipeta o preincubación con las formas de ésteres acetoximetilo de los colorantes. Sin embargo, estos métodos no son completamente aplicables a las uniones neuromusculares (NMJs) debido a cuestiones metodológicas que surgen. En este artículo presentamos un método para cargar un colorante sensible al calcio a través del tronco del nervio de la rana del nervio de la rana en las terminaciones nerviosas. Dado que la entrada de calcio externo en las terminales nerviosas y la posterior unión al colorante del calcio se producen dentro de la escala de tiempo de milisegundos, es necesario utilizar un sistema de imagen rápida para registrar estas interaccionesNs. Aquí, describimos un protocolo para registrar el transitorio de calcio con una cámara CCD rápida.
Los iones de calcio (Ca 2+ ) participan en muchos procesos de señalización neuronal, incluyendo la iniciación, el mantenimiento y la plasticidad de la liberación del mediador 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Al llegar el potencial de acción, el Ca2 + extracelular entra en el terminal nervioso e inicia la liberación del neurotransmisor. En algunas sinapsis, la corriente de calcio puede medirse directamente por métodos electrofisiológicos 6 , 7 , 8 . En el caso de la unión neuromuscular (NMJ), no se pueden utilizar técnicas de pinza de parche directo y de tensión de dos electrodos debido al tamaño diminuto de las terminaciones nerviosas.
Grabaciones de interior Ca 2 + corrientes de las terminaciones nerviosas en el NMJ se puede hacer por electrofys indirectaIológicos 9 , 10 . Sin embargo, estos métodos requieren el pretratamiento de la sinapsis por los bloqueadores de los canales iónicos de sodio y potasio. Los métodos ópticos no requieren la separación farmacológica de las corrientes iónicas en la terminal nerviosa y permiten registros de afluencia de Ca 2+ , desencadenados por los potenciales de acción, y la posterior elevación de iones Ca 2 + en el axoplasma 11 , 12 , 13 , 14 . Estos métodos se basan en grabaciones de cambios en la fluorescencia de colorantes específicos sensibles al Ca2 + sobre la unión de iones Ca2 + libres 15 , 16 , 17 , 18 , 19 .
Ca 2 + indicadores se pueden cargar en el cElls a través de una variedad de métodos, dependiendo del propósito del experimento. Los investigadores usan la aplicación en el baño de formas de colorante permeables a la membrana 20 , 21 , carga a través de la pipeta de parche 22 , o microinyección 23 , 24 , 25 . Sin embargo, todos estos métodos tienen algunas limitaciones en el caso del NMJ debido a sus peculiaridades en la arquitectura sináptica. Para el NMJ, el método más conveniente y exitoso es cargar el tinte a través del muñón nervioso, un método de llenado hacia delante 26 , 27 , 28 , 29 . Esta técnica puede utilizarse para cargar diversos colorantes fluorescentes en las terminaciones nerviosas periféricas. Este método se utilizó con éxito para las terminales nerviosas Drosophila 28 , el nervio motor lagarto28 , y las terminales nerviosas motoras de la rana 17 , 26 , 27 , 30 . Dependiendo del objeto en estudio, los detalles metódicos pueden variar. Una micro-pipeta de vidrio se puede emplear para los nervios pequeños de las larvas [ 28] . Varios investigadores han descrito un método 27 , 28 en el que un extremo recién cortado del nervio que inerva un músculo se sumerge en un pocillo precargado con un tinte. A continuación, la preparación se deja durante varias horas para sumergir el tinte. El colorante es absorbido por los axones y transportado a las terminales nerviosas. En este artículo, describimos un método de carga de un indicador de fluorescencia en las terminales nerviosas motoras de la rana a través del muñón nervioso. Nuestro protocolo utiliza una punta de pipeta de plástico para la incubación del tejido con un tinte. También se describe cómo adquirir y analizar Ca 2 + fluorescencia traNsients.
En este artículo presentamos el método de realizar la carga de colorante sensible al Ca2 + en las terminaciones nerviosas de la rana a través del muñón nervioso. Al final del procedimiento de carga, todos los terminales en la parte proximal del nervio tienen niveles significativos de fluorescencia. Se ha estimado que la concentración intraterminal de la sonda varía entre 40 y 150 μM [ 17] .
El procedimiento de incubación se lleva a cabo en dos etapas: a temperatura ambiente y luego a una temperatura más baja en un refrigerador. Es importante controlar el tiempo de incubación del tejido con el colorante a temperatura ambiente. Dependiendo de la longitud real del muñón nervioso, del colorante específico y de la temperatura, el tiempo de incubación puede variar. Si se sobreexpone, las terminales en las partes proximales cercanas al muñón nervioso pueden estar sobrecargadas. Sin embargo, en la parte media del nervio, todavía es posible encontrar terminales que se cargan satisfactoriamente. Durante elDespués de una larga incubación en el refrigerador, el colorante se distribuye uniformemente sobre las terminaciones nerviosas.
Nuestras propias observaciones [ 33 , 35] , así como los datos de otros investigadores [ 30] , demuestran la falta de influencia apreciable del procedimiento de carga sobre la amplitud de la respuesta postsináptica o sobre la frecuencia de los potenciales miniatura de la placa terminal. Se documentó una buena longevidad en las preparaciones cargadas. Hay algunos puntos importantes a los que queremos llamar la atención. Es muy esencial colocar el muñón nervioso en la solución de carga de colorante unos minutos después de la excisión para permitir que el colorante entre en los axones del nervio cortado; Los retrasos pueden causar una carga ineficaz, presumiblemente debido al resellado de los axones nerviosos 27 , 36 . Algunos investigadores sumergen el muñón nervioso en 100 mM de EDTA (un Ca 2 + – y Mg 2 + -chelator) Inmediatamente después de la extirpación del nervio para evitar que los axones cortados resellen. El tampón se retira después de 1-2 minutos y se reemplaza con una solución de carga de colorante 37 . El uso de un pozo de gelatina de petróleo en lugar de una tubería de plástico para el procedimiento de carga permite el uso de un muñón nervioso más corto. Mientras se usa este enfoque, el nervio se corta después de sumergido en la solución de HEPES con colorante, y los axones no se vuelven a sellar debido a la falta de iones divalentes en la solución de colorante 27 , 28 .
En nuestro estudio, se utilizó la forma de sal soluble en agua del indicador de Ca 2 + en lugar de dextrano. Los conjugados de dextrano difunden en el axón más lentamente que las formas de sal. Sin embargo, el uso del conjugado de dextrano reduce la compartimentación del colorante y la manipulación por el nervio y NMJs. El conjugado de dextrano verde de Calcio Verde de 1-3.000 MW tiene una buena tasa de difusión y demuestra una compartimentación reducida <s Up class = "xref"> 38.
Es muy importante evitar un largo período de iluminación fluorescente del tejido, ya que esto afecta su salud y supervivencia. Utilizamos la óptica de Nomarski en el canal de luz visible para buscar terminales nerviosas. Durante la grabación, limitamos el campo iluminado usando un diafragma.
Es de destacar que este método de carga es adecuado sólo para preparaciones que pueden soportar incubaciones largas. Para reducir el tiempo de carga de colorante cuando se realizan estudios en tejidos más frágiles ( por ejemplo, sinapsis de animales de sangre caliente), es necesario reducir la longitud del muñón nervioso y utilizar micropipetas para cargar 29 , 39 .
Esta técnica de carga es adecuada para los cambios de imagen en el Ca 2+ citosólico, con indicadores fluorescentes tanto en la estimulación de un solo nervio como en la actividad sináptica rítmicaEf "> 17 , 27 , 35. El análisis de la amplitud de transitorios de Ca 2+ puede utilizarse para estudiar la influencia de diferentes sustancias sobre la entrada de calcio que participa en la liberación de neurotransmisores 33 .
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación se realizó bajo el programa del Gobierno ruso para el crecimiento competitivo de la Universidad Federal de Kazan y una subvención de la Fundación Rusa para la Investigación Básica (16-04-01051; 16-34-00817; 15-04-02983). Damos las gracias a cuatro revisores anónimos por proporcionar comentarios útiles sobre borradores anteriores del manuscrito. Expresamos nuestro agradecimiento a Yuliya Aratskaya por la grabación de voz. Estamos agradecidos al Dr. Victor Ilyin por los muchos comentarios útiles y la ayuda con la edición final del manuscrito.
Ca2+ indicator | Molecular Probes, USA | Oregon Green 488 BAPTA-1 hexapotassium salt, O6806 | 500 μg |
Silicone Elastomer | Dow Corning, USA | Sylgard 184 elastomer | |
Pipette | Biohit, Russia | 720210 | 0.5-10µL |
Pipette tip | Fisher Scientific, USA | 02-707-175 | 10µL |
Pipette tip | Biohit, Russia | 781349 | 10µL |
Razor Blade | Fisher Scientific, USA | 12-640 | |
Minutien Pins | Fine scince tools, Canada | 26002-20 | |
Corneal Mini-Scissors | MT MEDI CORP, Canada | S-1111 | |
Jeweler Forceps | MT MEDI CORP, Canada | F-9610 | |
Jeweler Forceps | MT MEDI CORP, Canada | F-9611 | |
Modelling clay | local producer | can be replaced by any local producer | |
Petroleum jelly | local producer | can be replaced by any local producer | |
Microspin FV 2400 | Biosan, Latva | BS-010201-AAA | |
Multi-spin MSC 3000 | Biosan, Latva | BS-010205-AAN | |
Single-use hypodermic needles | Bbraun | 100 Sterican | 0.4×40mm |
Syrynge | local producer | 0.5 ml | |
HEPES | Sigma-Aldrich, USA | H0887 | 100ml |
Microscope, BX51 | Olympus, Japan | ||
Stereomicroscope, Leica М80 | Leica Microsystems , Germany | ||
Illumination system Leica CLS 150Х | Leica Microsystems, Germany | ||
Data acquisition system | Molecular Devices, USA | Digitdata 1550 | |
software | Molecular Devices, USA | pClamp software, Version 10 | protocol can be download from : http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with. RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro |
Bath and bath temperature controler | Experimental Builder | can be replaced by any chamber with temperature control. For example from https://www.warneronline.com/ | |
Monochromator | Till Photonics, Germany | Polychrome V | no longer available, can be replaced by other sutable stable light source 488 nm |
monochromator control software | Till Photonics, Germany | Polycon | |
Digital CCD camera | Redshirt imaging, USA | Neuro CCD SMQ | |
Model 2100 Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems, USA | ||
Suction electrode | Kazakov, A. Prostoj vsasyvajushhij jelektrod dlja jelektricheskoj stimuljacii biologicheskih ob’ektov / M.Aleksandrov, N.V.Zhilyakov, E.F. Khaziev, D.V. Samigullin // Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. - 2015. – T. 40. – №9. – S. 13-16. | http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii- biologicheskix-obektov/ |
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Acquisition software for CCD camera | Redshirt imaging, USA | Turbo SM software | |
ImageJ | National Institutes of Health, USA | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
Spreadsheet program | Microsoft, USA | Microsoft Office Excel |