여기에서는 칼슘에 민감한 염료를 개구리 신경 그루터기를 통해 신경 종말로 삽입하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 말초 신경 말단에서 빠른 칼슘 과도 현상의 기록과 분석을위한 프로토콜을 제시합니다.
시냅스 전 신경 말단에서 시냅스 전 칼슘 농도를 측정하는 가장 실현 가능한 방법 중 하나는 광학 기록입니다. 이것은 세포 내 자유 칼슘 농도에 따라 방출 강도 또는 파장을 변화시키는 칼슘 – 민감성 형광 염료를 사용하는 것을 기본으로합니다. 칼슘 염료로 세포를 얼룩지게하는 데 사용되는 몇 가지 방법이 있습니다. 가장 일반적으로 마이크로 피펫을 통해 염료를 로딩하거나 염료의 아세 톡시 메틸 에스테르 형태로 사전 배양하는 과정이 일반적입니다. 그러나 이러한 방법은 발생하는 방법 론적 문제로 인해 신경근 접합부 (NMU)에 적용 할 수 없습니다. 이 기사에서는 칼로리 감수성 염료를 개구리 신경의 개구리 신경 그루터기를 통해 신경 종말로 삽입하는 방법을 제시합니다. 신경 말단에 외부 칼슘이 들어가고 칼슘 염료에 결합하는 것이 밀리 초 단위로 발생하기 때문에 빠른 상호 작용 시스템을 사용하여 이러한 상호 작용을 기록 할 필요가 있습니다ns. 여기에서는 빠른 CCD 카메라로 칼슘 과도 현상을 기록하기위한 프로토콜에 대해 설명합니다.
칼슘 이온 (Ca 2+ )은 중개자 방출 1 , 2 , 3 , 4 , 5 의 개시, 유지 및 가소성을 포함하여 많은 연결 신호 과정에 참여합니다. 활동 전위가 도달하면, 세포 외 칼슘 2+ 는 신경 말단에 들어가고 신경 전달 물질 방출을 시작합니다. 일부 시냅스에서 칼슘 전류는 전기 생리 학적 방법으로 직접 측정 할 수 있습니다 6 , 7 , 8 . 신경근 접합부 (NMJ)의 경우 신경 말단의 미세한 크기 때문에 직접 패치 클램프와 2 전극 전압 클램프 기술을 사용할 수 없습니다.
NMJ의 신경 말단에서 내부 칼슘 2+ 전류의 기록은 간접 전기iological 방법 9 , 10 . 그러나, 이러한 방법은 나트륨 및 칼륨 이온 채널 차단제에 의한 시냅스의 전처리가 필요합니다. 광학적 방법은 신경 말단의 이온 전류를 약리학 적으로 분리 할 필요가 없으며, 활동 전위에 의해 유발 된 칼슘 이온 + 유입의 기록을 허용하고, 칼슘 이온 (axoplasm) 11 , 12 , 13 , 14 의 칼슘 이온의 상승을 허용한다. 이 방법은 자유 Ca 2+ 이온 15 , 16 , 17 , 18 , 19 의 결합시 특정 Ca 2+ 감응 염료의 형광 변화를 기록한 것입니다.
칼슘 2 + 지시약을 C에 넣을 수 있습니다.실험의 목적에 따라 다양한 방법으로 나타납니다. 연구원은 멤브레인 투과성 염료 형태 20 , 21 , 패치 피펫 22 또는 마이크로 인젝션 23 , 24 , 25 를 통해로드하는 욕조 응용을 사용합니다. 그러나 이러한 모든 방법들은 시냅스 건축가의 특이성 때문에 NMJ의 경우 약간의 제한이있다. NMJ의 경우, 가장 편리하고 성공적인 방법은 염색제를 신경 그루터기에 넣는 것, 전방 채움 방법 26 , 27 , 28 , 29 입니다. 이 기술은 말초 신경 종말에 다양한 형광 염료를로드하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 Drosophila 신경 말단 28 , 도마뱀 운동 신경28 ) 및 개구리 모터 신경 터미널 ( 17 , 26 , 27 , 30)을 포함한다 . 연구 대상에 따라 체계적인 세부 사항이 다를 수 있습니다. 유리 마이크로 피펫은 애벌레 28의 작은 신경에 사용할 수 있습니다. 몇몇 연구자들은 근육을 신경 주입하는 신경 끝이 염료로 미리 채워진 우물에 잠겨있는 방법 27 , 28 을 기술했다. 염료를 담그기 위해 몇 시간 동안 방치한다. 염료는 축색 돌기에 흡수되어 신경 말단으로 옮겨집니다. 이 논문에서는 개구리 모터 신경 말단에 형광 표시기를 삽입하는 방법을 설명한다. 우리의 프로토콜은 염료와 조직의 부화를 위해 플라스틱 피펫 팁을 사용합니다. 우리는 또한 칼슘 2 + 형광 트랩을 수집하고 분석하는 방법을 설명합니다nsients.
이 논문에서 우리는 신경 단단을 통해 개구리 신경 종말에 칼슘 2 + 감응 염료 로딩을 수행하는 방법을 제시했다. 적재 절차가 끝날 때까지 신경 근위 부분의 모든 말단에는 상당한 형광 수준이 있습니다. 프로브의 내부 – 말단 농도는 40 ~ 150 μM 사이 인 것으로 추측됩니다.
배양 과정은 두 단계로 진행됩니다 : 실온에서, 그리고 냉장고에서 더 낮은 온도에서. 상온에서 염료로 조직 배양 시간을 조절하는 것이 중요합니다. 신경 그루터기의 실제 길이, 특정 염료 및 온도에 따라 잠복기 시간이 다를 수 있습니다. 과다 노출되면, 신경 그루터기에 가까운 근위부의 터미널에 과부하가 걸릴 수 있습니다. 그러나 신경의 중간 부분에서, 만족스럽게로드 된 터미널을 찾을 수 있습니다. 동안냉장고에 장기간 배양하면 염료가 신경 종말에 고르게 분포합니다.
우리 자신의 관찰 33 , 35 및 다른 연구자 30 의 데이터는 postsynaptic response의 진폭이나 소형 end-plate 전위의 빈도에 대한 적재 절차의 감지 할 수없는 영향력이 없음을 증명합니다. 좋은 장수는 적재 된 준비에 문서화되었습니다. 우리가 주목하고 싶은 몇 가지 중요한 점이 있습니다. 염료가 절단 된 신경의 축삭으로 들어갈 수 있도록 절개 한 후 몇 분 안에 염료 로딩 용액에 신경 그루터기를 놓는 것이 매우 중요합니다. 지연은 아마도 신경 axons의 resealing로 인해, 효과가로드를 일으킬 수 있습니다 27 , 36 . 일부 연구자들은 100 mM EDTA (Ca 2+ – 및 Mg 2+ – 쉐이핑 제)에 신경 그루터기를 담그고) 절단 axons가 resealing에서 방지하기 위해 신경 excision 직후. 완충제는 1-2 분 후에 제거되고 염료 로딩 용액으로 교체된다. 적재 절차를 위해 플라스틱 튜빙 대신에 석유 젤리를 사용하면 더 짧은 신경 덩어리를 사용할 수 있습니다. 이 접근법을 사용하는 동안, 그것은 염료와 HEPES 솔루션에 잠겨있는 후 절단하고 axons은 염료 솔루션 27,28 에서 2가 이온의 부족 때문에 reseal하지 않습니다.
우리 연구에서 우리는 덱스 트란 대신 Ca 2+ 지시약의 수용성 소금 형태를 사용했다. 덱스 트란 접합체는 염 형태보다 축삭에서 더 천천히 퍼진다. 그러나, 덱스 트란 접합체의 사용은 신경 및 NMJ에 의한 염료 구획화 및 취급을 감소시킨다. 칼슘 녹색 1-3,000 MW 덱스 트란 접합체는 우수한 확산 속도를 가지며 감소 된 구획화를 보여줍니다 <s up class = "xref"> 38.
장기간의 형광등 조명을 피하는 것은 건강과 생존에 영향을주기 때문에 매우 중요합니다. 우리는 신경 터미널을 검색하기 위해 가시 광선 채널에서 노말 스키 광학을 사용합니다. 녹음하는 동안 우리는 조리개를 사용하여 조명 된 필드를 제한합니다.
이 로딩 방법은 오랫동안 잠복기를 견딜 수있는 준비에만 적합하다는 것이 주목됩니다. 연구가 더 연약한 조직 ( 예 : 온혈 동물의 시냅스)에서 수행 될 때 염료 로딩 시간을 줄이려면 신경 그루터기 길이를 줄이고 적재를 위해 마이크로 피펫을 사용해야합니다.
이 로딩 기술은 단일 신경 자극 및 리듬 시냅스 활동 모두에서 형광 표시기가있는 세포질 Ca 2+의 변화를 영상화하는 데 적합합니다ef "> 17 , 27 , 35. Ca 2+ 과도 현상 진폭 분석은 신경 전달 물질 방출에 관여하는 칼슘 유입에 대한 다양한 물질의 영향을 연구하는데 사용될 수있다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 카자흐 연방 대학교의 경쟁력있는 성장을위한 러시아 정부의 프로그램과 러시아 연구 기초 연구 (16-04-01051; 16-34-00817; 15-04-02983)에서 수행되었습니다. 원고 초안 초안에 도움이되는 의견을 제공 한 4 명의 익명 심사 위원에게 감사드립니다. 음성 녹음을 위해 Yuliya Aratskaya에게 감사의 말을 전합니다. 빅토르 일린 (Victor Ilyin) 박사에게 많은 도움이되는 의견과 필사본 편집에 대한 도움을 주신 데 대해 감사드립니다.
Ca2+ indicator | Molecular Probes, USA | Oregon Green 488 BAPTA-1 hexapotassium salt, O6806 | 500 μg |
Silicone Elastomer | Dow Corning, USA | Sylgard 184 elastomer | |
Pipette | Biohit, Russia | 720210 | 0.5-10µL |
Pipette tip | Fisher Scientific, USA | 02-707-175 | 10µL |
Pipette tip | Biohit, Russia | 781349 | 10µL |
Razor Blade | Fisher Scientific, USA | 12-640 | |
Minutien Pins | Fine scince tools, Canada | 26002-20 | |
Corneal Mini-Scissors | MT MEDI CORP, Canada | S-1111 | |
Jeweler Forceps | MT MEDI CORP, Canada | F-9610 | |
Jeweler Forceps | MT MEDI CORP, Canada | F-9611 | |
Modelling clay | local producer | can be replaced by any local producer | |
Petroleum jelly | local producer | can be replaced by any local producer | |
Microspin FV 2400 | Biosan, Latva | BS-010201-AAA | |
Multi-spin MSC 3000 | Biosan, Latva | BS-010205-AAN | |
Single-use hypodermic needles | Bbraun | 100 Sterican | 0.4×40mm |
Syrynge | local producer | 0.5 ml | |
HEPES | Sigma-Aldrich, USA | H0887 | 100ml |
Microscope, BX51 | Olympus, Japan | ||
Stereomicroscope, Leica М80 | Leica Microsystems , Germany | ||
Illumination system Leica CLS 150Х | Leica Microsystems, Germany | ||
Data acquisition system | Molecular Devices, USA | Digitdata 1550 | |
software | Molecular Devices, USA | pClamp software, Version 10 | protocol can be download from : http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with. RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro |
Bath and bath temperature controler | Experimental Builder | can be replaced by any chamber with temperature control. For example from https://www.warneronline.com/ | |
Monochromator | Till Photonics, Germany | Polychrome V | no longer available, can be replaced by other sutable stable light source 488 nm |
monochromator control software | Till Photonics, Germany | Polycon | |
Digital CCD camera | Redshirt imaging, USA | Neuro CCD SMQ | |
Model 2100 Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems, USA | ||
Suction electrode | Kazakov, A. Prostoj vsasyvajushhij jelektrod dlja jelektricheskoj stimuljacii biologicheskih ob’ektov / M.Aleksandrov, N.V.Zhilyakov, E.F. Khaziev, D.V. Samigullin // Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. - 2015. – T. 40. – №9. – S. 13-16. | http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii- biologicheskix-obektov/ |
|
Acquisition software for CCD camera | Redshirt imaging, USA | Turbo SM software | |
ImageJ | National Institutes of Health, USA | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
Spreadsheet program | Microsoft, USA | Microsoft Office Excel |