검출 실험 프로토콜<em> 시아 노 박테리아</em> 항체 마이크로 어레이 칩과 액체 및 고체 시료에
Summary
The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.
Abstract
지구 온난화와 부영양화는 일부 수생 생태계가 신속하고 대규모 시아 노 박테리아의 성장을 유발 true로 생물 반응기를 작동 할; 이 관련 건강과 경제적 결과가 있습니다. 대부분의 시아 노 박테리아 균주는 독소를 생산하며, 단지 몇 세포는 환경에 치명적인 손상을 유도 할 필요가있다. 따라서, 물 바디 당국과 정부는 예방 또는 치료 의사 결정을 지원하기 위해 신뢰할 수있는 데이터를 제공하는 신속하고 효율적인 조기 경보 시스템이 필요합니다. 이 원고는 분류 학적 해상도 (CYANOCHIP) 17 항체 (ABS)와 항체 마이크로 어레이 칩을 사용하여 독소를 생산하는 시아 노 박테리아 균주의에서 필드 검출을위한 실험 프로토콜을보고합니다. 여기에, 17 시아 노 박테리아 균주의 동시 모니터링을위한 멀티 플렉스 형광 샌드위치 마이크로 어레이 면역 (FSMI)이 자주 담수 생태계에 피는 발견, 그들 중 일부는 독소 생산자는 설명한다. 멀티있는 마이크로 어레이PLE CYANOCHIP의 (24까지) 동일한 복제 동시에 샘플의 비슷한 번호를 테스트하기 위해 하나의 현미경 슬라이드에 인쇄되었다. 액체 샘플은 항체 (ABS)과 직접 배양에 의해 또는 1 내지 3 μm의 필터를 통해 여과하여 세포 농도 이후에 테스트 할 수있다. 이러한 퇴적물 접지 바위 고체 시료는, 제 균질화 인큐베이션 완충액 휴대용 초음파에 의해 분산된다. 거친 물질을 제거하기 위해 – (20 μm의 5), 여과와 ABS 배양 그런 다음 여과된다. 면역 반응은 17 형광 표지 복근의 혼합물 최종 인큐베이션 드러난다 휴대용 형광 검출기에 의해 판독된다. 전체 과정은 대부분의 배양이 1 시간주기에 대응하는 약 3 시간 걸린다. 출력은 밝은 반점이 시아 노 박테리아 마커의 양의 검출에 대응하는 이미지입니다.
Introduction
검출하고 복잡한 자연 미생물 지역 사회의 미생물 모니터링 생물 의약, 환경 생태, 그리고 우주 생물학 등 많은 분야에서 중요하다. 조수의 셀 꽃 (과도 증식)을 형성하는 능력에 대해 공지의 원핵 미생물은 박테리아이다. 그들은 어디에나있다, 많은 종은 인간의 건강에 대한 잠재적 인 위험뿐만 아니라, 생태에 미치는 영향에뿐만 아니라 선도, 독소를 생성 할 수 있습니다. 이 점에서, 박테리아 및 / 또는 토양, 물에서의 독소의 조기 발견을위한 빠르고 민감한 방법을 개발하는 것이 필수적이다. 물 관리자가 적절한 물 관리 프로그램을 구현하는, 그 결과, 의사 결정을 도울 수 있도록이를 위해, 멀티 플렉스 형광 마이크로 어레이 샌드위치 면역 측정법 (FSMI)의 도구로 개발되고있다.
방법의 다양한 범위는 감지 시안 식별하기 위해 개발되었다광학 현미경, 분자 생물학 및 면역 학적 기술을 포함한 토양과 물에 obacterial 세포와 cyanotoxins. 이러한 방법은 그들이 제공하는 정보에 크게 다를 수 있습니다. 현미경 기술은 세포 형태 및 피코시 아닌 색소 등의 시아 노 박테리아로부터 생체 내 형광 감지 또는 1 클로로필에 기초한다. 그들은 유형과 샘플에 존재하는 시아 노 박테리아의 수에 대해 알려 실시간 자주 모니터링을위한 신속하고 저렴한 방법이 있지만, 그들은 잠재적 독성에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 또한, 그들은 종종 밀접한 관련 종이 구별하기가 매우 곤란하다는 점을 감안하면, 전문의 특정 수준을 필요로한다. 이러한 한계를 극복하기 위해 광학 현미경은 생물학 및 생화학 검사 분석 및 cyanotoxins의 식별 및 정량 물리 화학적 방법 모두 동반해야합니다.
<p클래스 = "jove_content"> 효소 면역 분석법 (ELISA), 단백질 인산 억제 분석 (PPIA), 및 생쥐에서 신경 화학 시험 cyanotoxins의 검출을위한 생화학 적 스크리닝 분석법의 예이다. 처음 두 빠르고 민감한 방법이지만하여 ELISA 및 PPIA 시험 독소의 세 가지 유형으로 제한되는 경우, 위양성이 설명되었다. 마우스 생물 검정이 필요 낮은 감도와 정밀도, 특별 라이선스 및 교육을 질적 기술이다. 또한, 시료에 존재하는 독소의 종류에 대한 정보를 제공하지 않는다. Cyanotoxins 식별 및 고성능 액체 크로마토 그래피와 같은 다른 분석법 (HPLC), 액체 크로마토 그래피 질량 분석에 의해 정량 할 수있다 (LC-MS), 가스 크로마토 그래피 (GC), 가스 크로마토 그래피 질량 분석 (GC-MS), 또는 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 시간 비행 (MALDI-TOF). 표준품 필요하는 경우, 이것은 가능복잡한 시료의 개별 독소의 농도를 결정하는 편은, 3, 4 사용할 수 있습니다. 또한,이 방법은 시간이 많이 소요된다; 비용이 많이 드는 장비, 소모품 및 샘플 준비가 필요합니다; 경험이 풍부한 전문 직원에 의해 수행되어야합니다.분자 기반 방법은 게놈 데이터베이스에 게시 된 순서 정보 덕분에, 탐지, 식별 및 시아 노 박테리아와 해당 cyanotoxins을 정량화하기 위해 수십 년 동안 적용되어왔다 (예를 들어, 생명 공학 정보, NCBI을위한 국립 센터). 이들 방법 중에서 DNA 증폭 용 프라이머 세트의 설계를 필요로하고 다른 시아 노 박테리아 종의 DNA 시퀀스의 사전 지식에 의존하는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 기초한 것들이다. 유전자 검출은 피코시 아닌 오페론 같은 속 레벨에서의 정확한 식별을 초래하지만, 어떤 종 또는 균주와 들키지있다이 방법. 그러나, 예를 들면 마이크로 시스틴 오페론에 속하는 것과 같은 독소를 코딩하는 유전자, 생산자는 5 부족하다 시료에서 독성 물질의 식별을 용이하게한다. 그럼에도 불구하고, PCR에 의한 독소 마커의 검출은 반드시 환경에 독성을 의미하지는 않습니다. 또한, 시료에 존재하는 박테리아 독소 생산 종의 전체 범위를 분석하기 위해 개발 된 프라이머 세트는 아직 완전하지 않으며, 추가적인 연구가 알려지지 종을 식별하기 위해 수행되어야한다. 다른 분자 기술 등 현장 하이브리드 (FISH) 및 DNA 마이크로 어레이에 형광 같이-PCR 비를 기준으로합니다.
지난 20 년 동안, 마이크로 어레이 기술은 특히 환경 모니터링, 응용 프로그램의 많은 분야에서 중요성을 얻고있다. DNA 마이크로 어레이는 종과 분석 (4) 사이의 차별, 6, 7 허용 </SUP>, 8, 9, 10, 그들은 거의 힘들고 시간 소모적 인 다단계 (예를 들어, 마이크로 어레이 성능 DNA 추출, PCR 증폭 및 혼성화) 관련 태스크를 고려한다. 그 때문에, 예컨대 샌드위치 경쟁 면역 마이크로 어레이와 같은 항체를 기반으로 적은 시간을 소모 분석은 여러 환경 분석 11 (12, 13)의 검출을위한 필수적인 안정적인 높은 처리량 방법이되었다. 항체의 기능을 구체적으로 타겟 화합물을 인식하고 거의 모든 물질에 대한 항체를 생산할 수있는 가능성과 함께, 분석 및 단백질의 적은 양을 검출, 항체 마이크로 어레이를 환경 적 용도를위한 강력한 방법을 만든다. 또한, 배수를 달성하는 능력은로 분석화롯불의 분석은, PPM로 PPB에 이르기까지 검출 한계,이 방법 (14)의 주요 장점 중 하나입니다.
항체 기반의 바이오 센서는 환경 모니터링 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 병원균 독소의 넓은 범위의 검출에 민감하고 신속한 도구로 입증되었다. DNA 방법은 여러 단계를 포함하는 반면, 항체 기반의 마이크로 어레이는 주로 적절한 용액 버퍼 짧은 용해 공정을 기반으로 작은 시료 전처리를 필요로한다. Delehanty 및 Ligler 15 4 PPB의의 단백질 농도를 검출 할 수있는 항체 샌드위치 면역 분석에 기초하여 단백질과 복합 혼합물 세균 분석 물의 동시 검출을보고D 10 4 CFU / 세포의 용액. Szkola 등. (21)는 생물학적 전쟁에 사용될 수 proteotoxins 작은 독소, 화합물의 동시 검출을위한 저렴하고 신뢰할 수있는 다중 마이크로 어레이를 개발했다. 그들은보다 20 분에서 3 PPB의 검출 한계로, 리신 독소의 농도를 감지했습니다. 최근 CYANOCHIP 독성 및 독성 박테리아의 시츄 검출, 항체 마이크로 어레이 기반 바이오 센서 (22)를 설명 하였다. 이 마이크로 어레이는 주로 현미경으로 식별하기 어려운 수생 환경에서 잠재적 인 시아 노 박테리아 꽃의 식별이 가능합니다. 심지어 종 레벨에서 다중 검출 및 박테리아의 식별을위한 비용 – 효과적인 수단이 바이오 센서로 선회 가장 종 × 103 세포 – 마이크로 어레이의 검출 한계는 10 2이다. 이러한 모든 속성은 antibo을DY 마이크로 어레이 기술이 연구에서 제시된 방법은 특히,보다 신속하고 간단한 방법은 상기 기술들에 비하여.
이 작업은 토양, 물 샘플에서 박테리아의 존재를 검출하기위한 마이크로 어레이, 항체 기반의 바이오 센서를 사용하는 실험의 두 가지 예를 나타낸다. 매우 작은 샘플 볼륨과 매우 기본적인 시료 전처리를 필요로하는 샌드위치 면역 분석법 포맷에 기초하여 간단하고 신뢰할 수있는 방법이다. 이 방법은 짧은 시간을 필요로하고 현장에서 쉽게 수행 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서, CYANOCHIP, 시아 노 박테리아 장군의 넓은 범위의 검출 및 식별을 위해 17 항체 마이크로 어레이를 이용하여 멀티 플렉스 형광 샌드위치 면역 검정은 22를 설명한다. 이 시아 노 박테리아는 담수 서식지에서 그들 중 일부있는 독소 생산을 가장 많이 저서 및 플랑크톤 장군을 나타냅니다. 최근, 형광 면역 샌드위치 형식 애플리케이션 환경 <sup class="xref"…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 시아 노 박테리아 균주를 제공하기 위해 대학교 자치시 마드리드에서 박사 안토니오 Quesada에 감사합니다. 이 작품은 스페인 Ministerio 드 Economía y를 Competitividad의 Subdirección 일반 드 Proyectos 드 Investigación (MINECO)에 의해 투자되었다, 더를 부여하지 않습니다. AYA2011-24803 및 ESP2014-58494-R.
Materials
| 0.22 mm pore diameter filters | Millipore | GSWP04700 | For preparation of immunogens |
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Fisher Scientific | For preparation of immunogens | |
| Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10X) | Thermofisher Scientific | 70011036 | 50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4 |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher | For preparation of immunogens | |
| Complete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Immunopotentiator |
| Incomplete Freud's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | For boost injections |
| Protein A antibody purification kit | Sigma-Aldrich | PURE1A | For isolation of IgG |
| Centrifugal filter devices MWCO<100 KDa | Millipore | UFC510096-96K | For isolation of IgG |
| Dialysis tubings, benzoylated | Sigma-Aldrich | D7884-10FT | For isolation of IgG |
| Illustra Microspin G-50 columns | GE-HealthCare | GE27-5330-02 | For isolation of IgG |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500 mL | To quantify the antibody concentration |
| MicroBCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23235 | To quantify the antibody concentration |
| Protein arraying buffer 2X | Whatman (Sigma Aldrich) | S00537 | Printing buffer; 30-40% glycerol in 1X PBS with 0.01% Tween 20 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Non-ionic detergent |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | Control for printing; blocking reagent |
| 384-wells microplate | Genetix | X6004 | For antibody printing |
| Robot arrayer for multiple slides | MicroGrid II TAS arrayer from Digilab | For antibody printing | |
| Epoxy substrate glass slides | Arrayit corporation | VEPO25C | Solid support for antibody printing |
| Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester | Molecular probes | A20006 | Fluorochrome |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Fluorochrome dissolvent |
| Heidolph Titramax vibrating platform shaker | Fisher Scientific | For antibody labeling | |
| Illustra Microspin G-50 columns | Healthcare | 27-5330-01 | For purification of labeled antibodies |
| Safe seal brown 0,5 ml tubes | Sarstedt | 72,704,001 | For labeled antibodies storage |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | To quantify antibody concentration and labeling efficiency | |
| 3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter | Millipore | TMTP04700 | To concentrate cells |
| 1M Trizma hydrochloride solution pH 8 | Sigma-Aldrich | T3038 | For TBSTRR preparation; to block slides |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | For TBSTRR preparation |
| 20 µm nylon filters | Millipore | NY2004700 | For environmental extract preparation |
| 10-12 mm filter holders | Millipore | SX0001300 | For environmental extract preparation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For environmental extract storage |
| 1M Trizma hydrochloride solution pH 9 | Sigma-Aldrich | T2819 | To block slides |
| Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker | VWR | To block slides; for incubation processes | |
| VWR Galaxy miniarray microcentrifuge | VWR | C1403-VWR | To dry slides |
| Multi-Well microarray hybridization cassette | Arrayit corporation | AHC1X24 | Cassette for 24 assays per slide |
| GenePix 4100A microarray scanner | Molecular Devices | Scanner for fluorescence | |
| GenePix Pro Software | Molecular Devices | Software for image analysis and quantification |
References
- Simis, S. G. H., Peters, S. W. M., Gons, H. J. Remote sensing of the cyanobacterial pigment phycocianin in turbid inland water. Limnol. Oceanogr. 50 (1), 237-245 (2005).
- Zamyadi, A., McQuaid, N., Prevost, M., Dorner, S. Monitoring of potentially toxic cyanobacteria using an online multi-probe in drinking water sources. J. Environ. Monit. 14, 579-588 (2012).
- Msagati, T. A. M., Siame, B. A., Shushu, D. D. Evaluation of methods for the isolation, detection and quantification of cyanobacterial hepatotoxins. Aquat. Toxicol. 78 (4), 382-397 (2006).
- Weller, M. G. Immunoassays and biosensors for the detection of cyanobacterial toxins in water. Sensors. 13 (11), 15085-15112 (2013).
- Baker, J. A., Neilan, B. A., Entsch, B., McKay, D. B. Identification of cyanobacteria and their toxigenicity in environmental samples by rapid molecular analysis. Environ. Toxicol. 16 (6), 472-482 (2001).
- Li, H., Singh, A. K., McIntyre, L. M., Sherman, L. A. Differential gene expression in response to hydrogen peroxide and the putative PerR regulon of Synechocystis sp. Strain PCC 6803. J. Bacteriol. 186 (11), 3331-3345 (2004).
- Anderson, D. M., Cembella, A. D., Hallegraeff, G. M. Progress in understanding harmful algal blooms: paradigm shifts and new technologies for research, monitoring, and management. Ann. Rev. Mar. Sci. 4, 143-176 (2012).
- Dittami, S. M., Pazos, Y., Laspra, M., Medlin, L. K. Microarray testing for the presence of toxic algae monitoring programme in Galicia (NW Spain). Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20, 6778-6793 (2013).
- Kegel, J. U., Del Amo, ., Medlin, Y., K, L. Introduction to Project MIDTAL: its methods and samples from Arcachon Bay, France. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20 (10), 6690-6704 (2013).
- Marcheggiani, S., et al. Detection of emerging and re-emerging pathogens in surface waters close to an urban area. Int. J. Environ. Res. Public Health. 12 (5), 5505-5527 (2015).
- Fernández-Calvo, P., Näke, C., Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A multi-array competitive immunoassay for the detection of broad-range molecular size organic compounds relevant for astrobiology. Planet. Space Sci. 54 (815), 1612-1621 (2006).
- Parro, V. . Antibody microarrays for environmental monitoring. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , 2699-2710 (2010).
- Fan, Z., Keum, Y. S., Li, Q. X., Shelver, W. L., Guo, L. H. Sensitive immunoassay detection of multiple environmental chemicals on protein microarrays using DNA/dye conjugate as a fluorescent label. J. Environ. Monit. 14 (5), 1345-1352 (2012).
- Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Moreno-Paz, M., Patricia Cruz-Gil, P., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A 200-Antibody microarray biochip for environmental monitoring: Searching for universal microbial biomarkers through immunoprofiling. Anal. Chem. 80 (21), 7970-7979 (2008).
- Delehanty, J. B., Ligler, F. S. A microarray immunoassay for simultaneous detection of proteins and bacteria. Anal. Chem. 74 (21), 5681-5687 (2002).
- Ligler, F. S., Taitt, C. R., Shriver-Lake, L. C., Sapsford, K. E., Shubin, Y., Golden, J. P. Array biosensor for detection of toxins. Anal. Bioanal. Chem. 377 (3), 469-477 (2003).
- Rucker, V. C., Havenstrite, K. L., Herr, A. E. Antibody microarrays for native toxin detection. Anal. Biochem. 339 (2), 262-270 (2005).
- Kang, J., Kim, S., Kwon, Y. Antibody-based biosensors for environmental monitoring. Toxicol. Environ. Health. Sci. 1 (3), 145-150 (2009).
- Herranz, S., Marazuela, M. D., Moreno-Bondi, M. C. Automated portable array biosensor for multisample microcystin analysis in freshwater samples. Biosens. Bioelectron. 33 (1), 50-55 (2012).
- Shlyapnikov, Y., et al. Rapid simultaneous ultrasensitive immunodetection of five bacterial toxins. Anal. Chem. 84 (13), 5596-5603 (2012).
- Szkola, A., et al. Rapid and simultaneous detection of ricin, staphylococcal enterotoxin B and saxitoxin by chemiluminescence-based microarray immunoassay. Analyst. 139, 5885-5892 (2014).
- Blanco, Y., Quesada, A., Gallardo-Carreño, I., Jacobo Aguirre, ., Parro, J., V, CYANOCHIP: An antibody microarray for high-taxonomical-resolution cyanobacterial monitoring. Environ. Sci. Technol. 49 (3), 1611-1620 (2015).
- Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Chem. 72, 248-254 (1976).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using Bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Rivas, L. A., Aguirre, J., Blanco, Y., González-Toril, E., Parro, V. Graph-based deconvolution analysis of multiplex sandwich microarray immunoassays: applications for environmental monitoring. Environ. Microbiol. 13 (6), 1421-1432 (2011).
- Blanco, Y., et al. Deciphering the prokaryotic community and metabolisms in south african deep-mine biofilms through antibody microarrays and graph theory. PloS One. 9 (2), e114180 (2014).
- Gas, F., Baus, B., Queré, J., Chapelle, A., Dreanno, C. Rapid detection and quantification of the marine toxic algae, Alexandrium minutum, using a super-paramagnetic immunochromatographic strip test. Talanta. 147, 581-589 (2016).
- Parro, V., et al. SOLID3: a multiplex antibody microarray-based optical sensor instrument for in situ life detection in planetary exploration. Astrobiology. 11, 15-28 (2011).
- McKay, C. P., et al. The Icebreaker Life Mission to Mars: a search for biomolecular evidence for life. Astrobiology. 13, 334-353 (2013).
