検出するための実験プロトコール<em>シアノバクテリア</em>抗体マイクロアレイチップと液体と固体試料中の

複雑な自然の微生物群集中の微生物の検出と監視は生物医学、環境、エコロジー、そして宇宙生物学などの多くの分野で重要です。淡水中の細胞の花（過剰増殖）を形成する能力についてよく知られている原核微生物はシアノバクテリアです。彼らは遍在している、と多くの種は、ヒトの健康に対する潜在的なリスクに、だけでなく、生態系への影響のみならず大手、毒素を産生することができます。この点では、 シアノバクテリアおよび/または土壌及び水中のそれらの毒素の早期検出のための迅速かつ高感度な方法を開発することが不可欠です。水管理者が適切な水管理プログラムを実施する際に、結果的に、決定にそれらを助けるために、この目的のために、多重蛍光サンドイッチマイクロアレイイムノアッセイ（FSMI）のツールとして開発されました。

方法の多様な範囲は、シアンを検出および同定するために開発されています光学顕微鏡、分子生物学、および免疫学的技術を含む土壌や水にobacterial細胞およびシアノトキシン、。これらの方法は、それらが提供する情報に大きく異なります。顕微鏡技術は、細胞の形態や、フィコシアニンやクロロフィル¹とシアノバクテリア顔料、からの生体内蛍光の検出に基づいています。彼らは、試料中に存在するシアノバクテリアの種類と数をお知らせリアルタイムおよび頻繁なモニタリングのための迅速かつ安価な方法であるが、それらは潜在的な毒性に関する情報を与えることはありません。さらに、彼らは、しばしば密接に関連した種²を区別することは非常に困難であることを考慮して、専門知識の特定のレベルを必要とします。これらの制限を克服するために、光学顕微鏡は、生物学的および生化学的スクリーニングアッセイおよびシアノトキシンの同定および定量のための物理化学的方法の両方を添付しなければなりません。

<pクラス= "jove_content">酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、タンパク質リン阻害アッセイ（PPIA）、およびマウスにおける神経化学的試験は、シアノトキシンを検出するための生化学的スクリーニングアッセイの例です。最初の二つは、迅速かつ高感度な方法論であるが、使用してELISAおよびPPIAテストは毒素の3種類に制限されている場合、偽陽性が記載されています。マウスバイオアッセイは、低感度および精度の質的な技術であり、特別なライセンスやトレーニングが必要です。また、試料中に存在する毒素の種類についての情報を与えません。シアノトキシン例えば、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）などの他の分析方法によって同定及び定量することができる、液体クロマトグラフィー – 質量分析（LC-MS）、ガスクロマトグラフィー（GC）、ガスクロマトグラフィー – 質量分析（GC-MS）またはマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間（MALDI-TOF）。参照標準、必要とされる場合は、これが唯一の可能性であります複雑なサンプル中の個々の毒素濃度を決定するためのedは^、3、4ご利用いただけます。また、これらの方法は時間がかかります。高価な機器、消耗品、およびサンプル調製を必要とします。そして、経験豊富な専門スタッフによって行われなければなりません。

分子ベースの方法は、ゲノムデータベースに公開された配列情報のおかげで、検出、同定、およびシアノバクテリアとそれらに対応するシアノトキシンを定量化するために数十年にわたって適用されている（ 例えば、バイオテクノロジー情報、NCBIのための国立センター）。これらの方法の中でDNAの増幅のためのプライマーセットの設計を必要とし、別のシアノバクテリア種のDNA配列の予備知識に依存してポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に基づくものです。遺伝子の検出は、フィコシアニンオペロンのように、属レベルでの正確な同定をもたらす一方で、一部の種や菌株がで検出されませんこの方法。しかしながら、このようなミクロオペロンに属するものとして毒素をコードする遺伝子は、プロデューサ⁵不足しているサンプル中の毒素の同定を容易にします。それにもかかわらず、PCRによる毒素マーカーの検出は、必ずしも環境に毒性を示すものではありません。また、 シアノバクテリアの種と試料中に存在する毒素生産の全範囲を分析するために開発されたプライマーのセットは、まだ不完全であり、更なる研究は、未知の種を同定するために行われなければなりません。他の分子技術は、 蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）およびDNAマイクロアレイなどの非PCRベースです。

過去20年間では、マイクロアレイ技術は、特に環境モニタリングでは、アプリケーションの多くの分野で重要性を増しています。 DNAマイクロアレイは、種との検体⁴の間の識別^、6、7を可能に</^{SUP>、8、9、10、}それらは非常に面倒で時間がかかる複数のステップ（ 例えば、マイクロアレイの性能、DNA抽出、PCR増幅、およびハイブリダイゼーション）を伴う作業を考えています。そのため、例えば、サンドイッチおよび競合免疫学的マイクロアレイのような抗体に基づいてより少ない時間のかかるアッセイは、多数の環境の分析物^11、12、13の検出のために不可欠で信頼性の高いハイスループット法となっています。抗体の能力は、特に、それらの標的化合物を認識し、ほとんどすべての物質に対する抗体を産生する可能性とともに、検体およびタンパク質の少量を検出するために、抗体マイクロアレイを環境目的のための強力な技術を作ります。また、複数を達成する能力は、として分析しますイングルアッセイは、ppmのppbの範囲の検出限界で、この方法¹⁴の主な利点の1つです。

抗体ベースのバイオセンサーは、環境モニタリング^{15、16、17、18、19、20、21}中の病原体および毒素の広い範囲を検出するための高感度かつ迅速なツールであることが判明しています。 DNA法は、いくつかのステップを含むが、抗体ベースのマイクロアレイは、主に適切なソリューションバッファ内の短い溶解段階に基づいて、小さなサンプル調製を必要とします。 DelehantyとLigler ^{15 4} PPBのANのタンパク質濃度を検出することができる抗体サンドイッチ免疫測定法に基づいて、複雑な混合物中のタンパク質および細菌分析物の同時検出を報告しD 10細胞の⁴ CFU / mLです。 Szkola ら。 ^21は生物兵器に使用されるかもしれないproteotoxinsと小さな毒素、化合物の同時検出のための安価で信頼性の高いマルチプレックスマイクロアレイを開発しました。彼らは20分未満で、3 ppbでの検出限界で、リシン毒素の濃度を検出しました。最近、CYANOCHIP、毒性および非毒性のシアノバクテリアのin situ検出のための抗体マイクロアレイベースのバイオセンサーは^、22に記載されています。このマイクロアレイは、主に顕微鏡的に識別することが困難である水生環境で、潜在的なシアノバクテリアブルームの同定を可能にします。でも、種レベルで、多重検出およびシアノバクテリアの同定のための費用対効果の高いツールにこのバイオセンサーを回すほとんどの種のために10 ³細胞、 -マイクロアレイの検出限界は10 ²です。これらのプロパティはすべてantiboを作りますDYマイクロアレイ技術、およびこの仕事で提示特に方法、前述の技術に比べて迅速かつ簡単な方法。

この作品は、土壌と水のサンプル中のシアノバクテリアの存在を検出するために抗体マイクロアレイベースのバイオセンサーを使用した実験の2つの例を示します。これは、非常に少量の試料と非常に基本的なサンプル調製を必要とするサンドイッチイムノアッセイフォーマットに基づいて簡単かつ信頼できる方法です。この方法は、短い時間を必要とし、容易フィールドで行うことができます。