Protocole expérimental pour la détection<em> cyanobactéries</em> Dans les échantillons liquides et solides avec un anticorps Microarray Chip

La détection et la surveillance des micro-organismes dans les communautés microbiennes naturelles complexes sont cruciales dans de nombreux domaines, y compris la biomédecine, l'écologie de l'environnement, et l'astrobiologie. Les cyanobactéries sont des micro – organismes procaryotes bien connus pour leur capacité à former des fleurs (prolifération excessive) des cellules dans l' eau douce. Ils sont omniprésents, et de nombreuses espèces sont capables de produire des toxines, ce qui conduit non seulement à un risque potentiel pour la santé humaine, mais aussi à un impact écologique. À cet égard, il est essentiel de développer des méthodes rapides et sensibles pour la détection précoce des cyanobactéries et / ou leurs toxines dans le sol et l' eau. A cet effet, un fluorescent immunologique sandwich microarray multiplex (FSMI) a été développé comme un outil pour les gestionnaires de l'eau afin de les aider à prendre des décisions et, par conséquent, la mise en œuvre des programmes de gestion de l'eau.

Un large éventail de méthodes a été développé pour détecter et identifier cyancellules obacterial et cyanotoxines dans le sol et l'eau, y compris la microscopie optique, la biologie moléculaire et des techniques immunologiques. Ces méthodes peuvent varier considérablement dans les informations qu'ils fournissent. Techniques microscopiques sont basés sur la morphologie des cellules et la détection de la fluorescence in vivo à partir de pigments, tels que les cyanobactéries phycocyanine ou la chlorophylle a ^1. Bien qu'ils soient des méthodes rapides et bon marché pour en temps réel et une surveillance fréquente qui informent sur le type et le nombre de cyanobactéries présentes dans un échantillon, ils ne donnent pas d' informations sur la toxicité potentielle. En outre, ils ont besoin d' un certain niveau d'expertise, estimant qu'il est souvent très difficile de faire la distinction entre les espèces étroitement apparentées ^2. Pour surmonter ces limitations, la microscopie optique doit être accompagnée par les deux essais de criblage biologiques et biochimiques et méthodes physico-chimiques pour l'identification et la quantification des cyanotoxines.

<pclass = "jove_content"> dosages immuno-enzymatiques (ELISA), des essais d'inhibition de phosphate de protéines (LPRP), et des tests neurochimiques chez la souris sont des exemples de tests de dépistage biochimiques pour la détection de cyanotoxines. Alors que les deux premiers sont des méthodes rapides et sensibles, les faux positifs ont été décrits lors de l'utilisation des tests ELISA et ÉPFVP sont limités à trois types de toxines. Le test souris est une technique qualitative avec une faible sensibilité et la précision, et une licence spéciale et de formation est nécessaire. En outre, il ne donne pas d'informations sur le type de toxines présentes dans un échantillon. Cyanotoxines peuvent être identifiés et quantifiés par d'autres méthodes d'analyse, telles que la chromatographie liquide à haute performance (HPLC), la spectrométrie de chromatographie en masse liquide (LC-MS), chromatographie en phase gazeuse (GC), chromatographie-spectrométrie de masse de gaz (GC-MS), ou laser temps désorption / ionisation assistée par matrice de vol (MALDI-TOF). Toutefois, cela est possible uniquement si les normes de référence, qui sont besoined pour déterminer les concentrations de toxines individuelles dans des échantillons complexes, sont disponibles ^{3, 4.} En outre, ces procédés prennent du temps; nécessitent des équipements coûteux, les fournitures et la préparation des échantillons; et doit être exécuté par un personnel expérimenté et spécialisé.

Les méthodes moléculaires à base ont été appliquées depuis des décennies pour détecter, identifier et quantifier les cyanobactéries et cyanotoxines leurs correspondants grâce à l'information de séquence publiée dans les bases de données du génome (par exemple, National Center for Biotechnology Information, NCBI). Parmi ces méthodes sont celles basées sur l'amplification en chaîne par polymérase (PCR), ce qui nécessite la conception d'ensembles d'amorces pour l'amplification de l'ADN et dépendent de la connaissance préalable des séquences d'ADN de différentes espèces de cyanobactéries. Bien que la détection du gène, comme l'opéron phycocyanine, conduit à une identification précise au niveau du genre, certaines espèces ou souches ne sont pas détectés aveccette méthode. Cependant, les gènes codant pour une toxine, tels que ceux appartenant à l'opéron microcystine, faciliter l'identification des toxines dans les échantillons où les producteurs sont rares ^5. Néanmoins, la détection de marqueurs de toxine par PCR ne signifie pas nécessairement une toxicité dans l'environnement. En outre, l'ensemble des amorces développées pour analyser l'ensemble des espèces de producteurs de cyanobactéries et de toxines présentes dans un échantillon est encore incomplète, et d' autres études doivent être réalisées pour identifier des espèces inconnues. D' autres techniques de biologie moléculaire sont basées sur la PCR-non, comme l' hybridation fluorescente in situ (FISH) , et des puces à ADN dans.

Au cours des deux dernières décennies, la technologie des microréseaux a gagné en importance dans de nombreux domaines d'application, en particulier dans la surveillance environnementale. Les puces à ADN permettent une distinction entre les espèces et les analytes ^{4, 6, 7} </^{sup>, 8, 9, 10,} mais elles sont considérées comme très laborieuse et prend du temps des tâches qui impliquent plusieurs étapes (par exemple, les performances des puces à ADN, l' extraction de l' ADN, amplification par PCR et d' hybridation). Pour cette raison, les dosages moins consommatrices de temps basées sur des anticorps, tels que les biopuces immunologiques sandwich et compétitives, sont devenus une méthode à haut débit essentiel et fiable pour la détection d'analytes multiples de l' environnement ^{11, 12, 13.} La capacité des anticorps à reconnaître spécifiquement les composés cibles et de détecter de petites quantités d'analytes et de protéines, ainsi que la possibilité de produire des anticorps contre pratiquement toute substance, faire microréseaux d'anticorps une technique puissante pour des fins environnementales. En outre, la possibilité de réaliser des analyses multiples en tant quedosage Ingle, avec des limites de détection variant de ppb à ppm, est l' un des principaux avantages de cette méthode ^14.

Biocapteurs à base d' anticorps se sont révélés être des outils sensibles et rapides pour la détection d'une large gamme d'agents pathogènes et de toxines dans la surveillance environnementale ^{15, 16, 17, 18, 19, 20, 21.} Bien que les méthodes d'ADN impliquent plusieurs étapes, les microréseaux à base d'anticorps ne nécessitent qu'une petite préparation de l'échantillon qui est principalement basée sur une étape de lyse courte dans un tampon de solution appropriée. Ligler Delehanty et ¹⁵ ont rapporté la détection simultanée des protéines bactériennes et des analytes dans des mélanges complexes à base d'un dosage immunologique sandwich d' anticorps capable de détecter une concentration en protéine de 4 parties par milliard d'j 10 ⁴ ufc / ml de cellules. Szkola et al. ²¹ ont développé un microréseau multiplex fiable et pas cher pour la détection simultanée de proteotoxins et de petites toxines, des composés qui pourraient être utilisés dans la guerre biologique. Ils ont détecté des concentrations de toxine ricine, avec une limite de détection de 3 parties par milliard, en moins de 20 min. Récemment, le CYANOCHIP, un biocapteur basé sur un microréseau d'anticorps pour la détection in situ de cyanobactéries toxiques et non toxiques, a été décrite ^22. Cette microarray permet l'identification des cyanobactéries blooms potentiels, surtout dans les milieux aquatiques, qui sont difficiles à identifier au microscope. La limite de détection de la puce est de 10 ^{mars 2 à 10} cellules pour la plupart des espèces, en tournant ce biocapteur dans un outil rentable pour la détection multiplex et l' identification des cyanobactéries, même au niveau de l' espèce. Toutes ces propriétés font l'Antibotechnique de microarray dy, et en particulier la méthode présentée dans ce travail, une méthode plus rapide et plus simple par rapport aux techniques mentionnées ci-dessus.

Ce travail présente deux exemples d'expériences qui utilisent un biocapteur à base de puces à ADN-anticorps pour détecter la présence de cyanobactéries dans des échantillons de sol et d' eau. Il est une méthode simple et fiable basé sur un format de dosage immunologique en sandwich qui nécessite des volumes d'échantillons très petits et la préparation des échantillons très basique. La méthode nécessite un court laps de temps et peut facilement être effectuée sur le terrain.