Summary

باستخدام الأشعة السينية البلورات، الفيزياء الحيوية، وفحوصات وظيفية لتحديد آليات الحكم تي خلية مستقبلات الاعتراف السرطان المستضدات

Published: February 06, 2017
doi:

Summary

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

Abstract

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Introduction

وكانت الأشعة السينية البلورات، وستظل، وهي تقنية قوية للغاية لفهم طبيعة التفاعلات يجند مستقبلات. من خلال وضع تصور هذه التفاعلات بالتفصيل الذري، وليس فقط هل من الممكن الكشف عن الآليات الجزيئية التي تحكم العديد من العمليات البيولوجية، ولكن من الممكن أيضا أن يغير مباشرة واجهات الاتصال لفائدة علاجية. إلى جانب تقنيات مثل الرنين مأكل السطح والكالوري المعايرة متساوي الحرارة (على سبيل المثال لا زوجين)، ويمكن بعد هذه التعديلات سيتم تحليلها biophysically لتقييم تأثير مباشر على تقارب ملزمة، حركية التفاعل، والديناميكا الحرارية. وأخيرا، من خلال إجراء التجارب وظيفية على أنواع الخلايا ذات الصلة، صورة مفصلة عن تأثير الجزيئية والوظيفية من التعديلات على التفاعلات مستقبلات يجند يمكن استخلاصها، وتوفير المعلومات الآلية محددة للغاية. عموما، هذه الأنواع من طرق تقديم صورة قرار الذرية تمكين ردع mination لكيفية النظم البيولوجية العمل، مع الآثار المصاحبة للتقدم التشخيصية والعلاجية.

مختبرنا يستخدم بشكل روتيني هذه التقنيات لدراسة المستقبلات التي تتوسط الإنسان مناعة الخلايا التائية لمسببات الأمراض والسرطان، في المناعة الذاتية، وخلال زرع. هنا، ونحن نركز على CD8 + استجابة خلايا T الإنسان بالسرطان، بوساطة التفاعل بين مستقبلات الخلايا التائية (TCR) ومستضد الكريات البيض البشرية (HLA) -restricted الببتيدات المستمدة من الورم (pHLA). هذا مهم جدا لأنه، على الرغم من أن خلايا CD8 + T قادرة على استهداف الخلايا السرطانية، نحن وغيرنا قد أظهرت في وقت سابق ان TCRs المضادة للسرطان ربط الحالات النادرة إلى pHLA المشابهة لها 2. وهكذا، وقد حاول العديد من المختبرات لتغيير إما TCR 5 أو الببتيد يجند الطبقة = "XREF"> وذلك لزيادة المناعة وتحسين الخلايا السرطانية المستهدفة. ومع ذلك، هذه الأساليب ليست فعالة دائما، ويمكن أن يكون لها آثار جانبية خطيرة، بما في ذلك بعيدا عن الهدف السميات 4 و 9 و 10. وإجراء مزيد من البحوث استكشاف الآليات الجزيئية التي تحكم الاعتراف تي خلية من مستضدات السرطان أمرا حيويا للتغلب على هذا النقص.

في هذه الدراسة، وركزنا على ردود ضد خلايا سرطان الجلد ذاتي من قبل خلايا CD8 + T معينة للحصول على جزء من المستضد تمايز الخلايا الصباغية بروتين سكري 100 (GP100)، GP100 280-288، التي قدمها HLA-A * 0201 (الأكثر شيوعا -expressed الطبقة pHLA الإنسان الأول). وقد تم هذا المستضد هدفا درس على نطاق واسع لعلاج مناعي سرطان الجلد، وقد تم تطويره ليصبح ما يسمى الببتيد "heteroclitic" فيه حمض أميني أساسي محل ألانينفي موقف مرساة 9 إلى تحسين pHLA الاستقرار 11. وقد استخدم هذا النهج لتعزيز تحريض CTLs-سرطان الجلد على رد الفعل في المختبر، وقد استخدمت بنجاح في التجارب السريرية 12. ومع ذلك، يمكن إدخال تعديلات على بقايا الببتيد لها آثار لا يمكن التنبؤ بها على خصوصية خلايا T، ويتجلى ذلك في فعالية الفقيرة من معظم الببتيدات heterolitic في العيادة 6 و 13. وبالفعل، شكل heteroclitic آخر من GP100 280-288، الذي بقايا الببتيد تم استبداله باللاعب Glu3 لعلاء، ألغى الاعتراف من قبل السكان بولكلونل من GP100 280-288 خلايا T -specific 14 و 15. لقد أثبتنا سابقا أن حتى تغييرات طفيفة في بقايا الببتيد مرساة يمكن أن يغير إلى حد كبير الاعتراف تي خلية بطرق غير متوقعة 16. وهكذا، ركزت الدراسة على بناءيمكن جي صورة أكثر تفصيلا لكيفية تعترف خلايا CD8 + T GP100 وكيفية إدخال تعديلات على التفاعل بين TCRs وpHLA تؤثر هذه الوظيفة.

هنا، ولدت لنا نقية للغاية، أشكال قابلة للذوبان من اثنين TCRs محددة لGP100 280-288 قدمها HLA-A * 0201 (A2-YLE)، فضلا عن الأشكال الطبيعية وتغير من pHLA. واستخدمت هذه الكواشف لتوليد بلورات البروتين لحل التركيب الذري الثلاثي من TCR البشري في مجمع مع شكل heteroclitic من A2-YLE، فضلا عن اثنين من pHLAs متحولة في شكل unligated. ثم استخدمنا منهج المسح الببتيد لتوضيح تأثير بدائل الببتيد على TCRs عن طريق أداء في عمق التجارب الفيزيائية الحيوية. وأخيرا، فإننا ولدت CD8 + خط تي خلية المعدلة وراثيا، وإعادة برمجتها للتعبير عن واحدة من TCRs A2-مط محددة، من أجل إجراء تجارب وظيفية لاختبار تأثير البيولوجي من مختلف التعديلات الببتيد. وهذه البيانات تظهر أن مودي حتىمواشفات إلى الببتيد المخلفات التي هي خارج عزر ملزمة TCR يمكن أن يكون لا يمكن التنبؤ بها أثره على بقايا الببتيد المجاورة التي تلغي TCR ملزمة والاعتراف تي خلية. وتمثل النتائج التي توصلنا إليها في المثال الأول من الآليات الهيكلية الكامنة وراء الاعتراف تي خلية من هذا الهدف العلاجي مهم لسرطان الجلد.

Protocol

1. بروتين التعبير جعل يبني الجينات لتوليد TCRs القابلة للذوبان وpHLAs، كما هو موضح بالتفصيل سابقا 17 و 18. تصميم كل بناء مع 5 "BamH1 و3" موقع EcoR1 قيود على الإدراج في ناقلات pGMT7. تحويل كولاي رشيد (DE3) pLysS مع ناقل البلازميد المستمدة pGMT7 التي تحتوي على تسلسل ترميز البروتين من الفائدة التي يحتضنها 1 ميكرولتر من 50-200 نانوغرام / ميكرولتر البلازميد مع 5 ميكرولتر من القولونية لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية ، 2 دقيقة في 42 درجة مئوية، و 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، ولوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية على صفيحة أجار LB تستكمل مع 50 ملغ / لتر كربنيسيلين. اختيار المستعمرات الفردية وينمو بمعدل 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة في 30 مل من وسائل الاعلام الطباع (16 جم / لتر تريبتون، 16 جرام / لتر خلاصة الخميرة، و 5 ز / L هونج كونج 2 O 4) تستكمل مع 100 كربنيسيلين ميكرومتر حتى تعليق يصل في دي البصريةnsity (OD 600) من بين 0.4 و 0.6. حث إنتاج البروتين في 5 مل قسامة من خلال تقديم 0.5 ملي الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) لمدة 3 ساعات. تبقي 20 ميكرولتر من تعليق مع وبدون تحريض لالكهربائي دوديسيل كبريتات الصوديوم بولي أكريلاميد هلام تحليل (SDS-PAGE) وصمة عار على هلام. إضافة الثقافات بداية إلى 1 لتر من الطرق والجسور تستكمل مع 100 كربنيسيلين ميكرومتر وتنمو الخلايا كما هو موضح أعلاه في الخطوة 1.3 حتى يصل تعليق على OD 600 بين 0.4 و 0.6. حمل تعبير البروتين لمدة 3 ساعات مع 0.5 ملي IPTG. الطرد المركزي الخلايا لمدة 20 دقيقة في 3000 x ج وتخلصي من طاف بعناية. حل بيليه في 40 مل من تحلل العازلة (10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.1 و 10 ملي كلوريد المغنيسيوم، MgCl 2، 150 مم كلوريد الصوديوم، والجلسرين 10٪)، يصوتن على الجليد على السلطة مدة 30 دقيقة في 60٪ باستخدام 2 ثانية فاصل ويحضن في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة مع 0.1 جم / لتر الدناز. علاج سوسالتقاعد التي تحتوي على البروتينات في شكل هيئات إدراج (IB) مع 100 مل من غسل العازلة (0.5٪ تريتون X-100 و 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.1؛ 100 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي EDTA). الطرد المركزي العينة لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية، و8،000 x ج وتخلصي من طاف بعناية. إعادة تعليق بيليه في 100 مل من العازلة إعادة تعليق (50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.1؛ 100 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.1)، الطرد المركزي كما كان من قبل في 8000 x ج، وتخلصي من طاف بعناية. أخيرا، حل بيليه في 10 مل من العازلة غوانيدين (6 M غوانيدين و 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.1، 2 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.1، و 100 مم كلوريد الصوديوم) وقياس تركيز البروتين في 280 نانومتر باستخدام مطياف. 2. pHLA وTCR Refolding لrefolds pHLA، مزيج 30 ملغ من HLA-A2 (أو HLA-A2 مع علامة البيوتين) المعرفين، 30 ملغ من β2m وسطاء، و 4 ملغ من الببتيد لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي في الحجم النهائي من 6 مل من العازلة غوانيدين تستكمل مع dithiothreitol 10 ملي(DTT). بدء refolding البروتين عن طريق تمييع المزيج السابق في 1 لتر من منطقة عازلة HLA refold قبل المبردة (50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.1 و 400 مم L-أرجينين، 2 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.1 و 6 ملي cysteamine، و 4 ملي cystamine). مغادرة HLA refold اثارة في 4 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ومن ثم نقلها إلى 12.4 كيلو دالتون MWCO (الوزن الجزيئي قطع) أنبوب غسيل الكلى وdialyze مرتين لمدة 24 ساعة مقابل 20 L 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.1. لrefolds TCR، مزيج 30 ملغ من TCR سلسلة α وسطاء و 30 ملغ من TCR سلسلة β آي بي لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي في 6 مل من العازلة غوانيدين تستكمل مع 10 ملي DTT. بدء refolding البروتين عن طريق تمييع الخليط TCR التشويه والتحريف في 1 لتر من منطقة عازلة TCR refold قبل المبردة (50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.1؛ 2.5 M اليوريا، 2 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.1 و 6 ملي cysteamine، و 4 ملي cystamine) لمدة 3 ح. نقل refold في أنبوب غسيل الكلى 12.4 كيلو دالتون MWCO وdialyze مرتين لمدة 24 ساعة مقابل 20 L 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.1. تصفية كل من pHLA أو TCR المرجعالذين تتراوح أعمارهم بين باستخدام فلتر الغشاء 0.45 ميكرون للخطوات تنقية. 3. تنقية من البروتين سريع اللوني السائل (FPLC) تحميل إعداد refold تصفيتها (إما pHLA أو TCR) على 7.9 مل، 50 ميكرومتر أنيون العمود راتنج التبادل قبل معايرتها مع 20 مل من 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.1 على نظام اللوني مرنة وبديهية. أزل البروتين في 5 مل / دقيقة مع التدرج الملح (كلوريد الصوديوم 0-500 ملم في 10 ملم تريس، ودرجة الحموضة 8.1، أكثر من 8 مجلدات عمود) وجمع الكسور 1 مل. تحليل الكسور المقابلة لبروتين من الاهتمام من قبل SDS-PAGE، تجميع الكسور التي تحتوي على البروتين من الفائدة معا، والتركيز عليهم إلى 500 ميكرولتر مع 10 كيلو دالتون MWCO 20 أو 10 كيلو دالتون MWCO 4 بواسطة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 4000 x ج ، التخلص من التدفق من خلال. تحميل الاستعدادات البروتين تتركز في 2 مل حقن حلقة على 24 مل حجم العمود الاستبعاد اللوني قبل معايرتها مع التطبيقعازلة ropriate شطف: الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، مسح ميزانية الأسرة (10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم، 3.4 ملي EDTA، و 0.005٪ السطحي)، أو عازلة الكريستال (10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.1، و 10 ملي كلوريد الصوديوم ). أزل البروتينات في معدل تدفق 0.5 مل / دقيقة أكثر من 1 عمود الحجم؛ جمع 1 كسور مل تحتوي على البروتين من الفائدة التحقق من SDS-PAGE. ملاحظة: استخدمت هذه الأساليب لتوليد القابلة للذوبان PMEL17 TCR وGP100 TCRs، وكذلك كل من pHLAs المستخدمة في هذه الدراسة: HLA-A * 0201 مع YLEPGPVTA (A2-YLE)، YLEPGPVTV (A2-مط-9V)، ALEPGPVTA (A2-YLE-1A)، YLAPGPVTA (A2-مط-3A)، YLEAGPVTA (A2-مط-4A)، YLEPAPVTA (A2-مط-5A)، YLEPGAVTA (A2-مط-6A)، YLEPGPATA (A2-YLE- 7A)، أو YLEPGPVAA (A2-مط-8A). 4. سطح بلازمون الرنين (SPR) تحليل لتحليل ملزم التوازن أو تحليل الحرارية باستخدام نظام تحليل التفاعل الجزيئي مجهزة CM5 رقاقة الاستشعار 19. تفعيل شريحة CM5 التي كتبها fخوار 1: مزيج 1 من 100 ملي N-hydroxysuccinimide (NHS) و 400 ملي 1-إيثيل-3- (3-dimethylpropyl) -carboiimide (EDC) لمدة 10 دقيقة بمعدل تدفق 10 ميكرولتر / دقيقة، وعند 25 درجة C. تحميل ما يقرب من 5000 وحدة استجابة (RU) من streptavidin (110 ميكرولتر من 200 ميكروغرام / مل في 10 ملي خلات، ودرجة الحموضة 4.5) من خلال التساهمية ربط على سطح رقاقة في جميع خلايا تدفق أربعة واستخدام 100 ميكرولتر من 1 M إيثانولامين هيدروكلوريد لإيقاف أي مجموعة رد الفعل المتبقية. زوجان حوالي 500-600 RU من pHLA، في ~ 1 ميكرومتر في المخزن التجاري (المقدمة من قبل الشركة المصنعة)، إلى رقاقة الاستشعار CM5 بمعدل تدفق بطيء من 10 ميكرولتر / دقيقة لضمان توزيع منتظم على سطح رقاقة. تشبع سطح رقاقة مع 1 البيوتين ملم في المخزن التجاري (المقدمة من قبل الشركة المصنعة) لمدة 60 ثانية. حقن عشرة التخفيفات المسلسل من TCRs القابلة للذوبان أكثر من وتدفق الخلايا ذات الصلة بمعدل تدفق عال من 30 ميكرولتر / دقيقة عند 25 درجة مئوية. حساب ثابت ملزم التوازن(K D (E)) القيم باستخدام نوبة غير الخطية منحنى (ذ = (P1x) / (P2 + س)) 20. ملاحظة: وحدات ذ = ردا على ذلك، س = تركيز المحلل، P1 = ص كحد أقصى، P2 = K D. لتحليل حركية افتراض 1: انجميور 1 ملزمة واحتواء البيانات باستخدام خوارزمية العالمية لتناسب في حزمة البرامج 2. أداء الديناميكا الحرارية التجارب بتكرار هذه الطريقة في درجات الحرارة التالية: 5 درجة مئوية و 12 درجة مئوية و 18 درجة مئوية و 25 درجة مئوية، و 30 درجة مئوية (19). استخدام القيم K D يحددها SPR عند درجات حرارة مختلفة لحساب ΔG ° باستخدام المعادلة الحرارية القياسية (ΔG ° = -RTlnK D) 19. ملاحظة: R = الغاز ثابت، T = درجة الحرارة في K، LN = سجل الطبيعية. حساب المعلمات الحرارية وفقا للمعادلة جيبس-هيلمهولتز (ΔG ° = ΔH – TΔS درجة) 19. </لى> رسم الطاقات ملزم الحرة، ΔG درجة (ΔG ° = -RTlnK D)، ضد الحرارة (K) باستخدام الانحدار غير الخطية لتناسب المعادلة ثلاثة معلمة (ذ = ΔH + ΔCp * (س 298) -x * ΔS- س * ΔCp * قانون الجنسية (خ / 298)) 19. ملاحظة: ص = درجة الحرارة في K، س = ΔG درجة. 5. متساوي الكالوري المعايرة (ITC) إجراء تجارب مركز التجارة الدولية باستخدام المسعر المعايرة متحاور. ضخ 30 ميكرومتر pHLA في الخلية المسعر وتحميل 210 ميكرومتر ذوبان TCR في حقنة. استخدام الظروف العازلة التالية: 20 ملي HEPES (7.4 درجة الحموضة) التي تحتوي على 150 ملي مول كلوريد الصوديوم. أداء 20 الحقن TCR، كل من حجم 2 ميكرولتر. حساب ΔH وK D باستخدام البرامج التحليلية. 6. بلورة وجمع البيانات الحيود، ونموذج صقل أداء التجارب تبلور باستخدام الروبوت التبلور. بلورات من فبأو نشرها في 18 ° C عبر تقنية هبوط يجلس في لوحة 96-جيدا مع خزان يحتوي على 60 ميكرولتر من العازلة تبلور (الأم الخمور) 21. تركيز pHLA قابل للذوبان إلى ما يقرب من 10 ملغ / مل (0.2 ملم) في المخزن وضوح الشمس من خلال الدوران في 3000 x ج في 10 كيلو دالتون الوزن الجزيئي قطع المكثف الطرد المركزي. لهياكل شارك معقدة، خلط TCR وpHLA في نسبة 1: 1 المولي للحصول على حل البروتين في ما يقرب من 10 ملغ / مل (0.1 ملم). إضافة 200 NL من pHLA وحده، أو 1: 1 المولي مزيج نسبة TCR وpHLA، إلى 200 NL كل خزان حل من الشاشة بلورة باستخدام الروبوت تبلور ويسجل لبلورات تحت المجهر بعد 24 ساعة، 48 ساعة، 72 ح، ثم مرة واحدة في الأسبوع. البلورات الحصاد عن طريق تركيب عليها يدويا في البرد حلقات تحت المجهر والبرد تبريد لهم من قبل غمر وتخزينها في النيتروجين السائل (100 K). ملاحظة: تحميل البلورات تأخذ قليلا من الاستشارية لاستعراض المشترياتتايس، والبت فيها بلورات هي جيدة بما فيه الكفاية لجمع البيانات يأتي مع الخبرة. وكقاعدة عامة من الإبهام، وأكبر وأكثر انتظاما وضوح الشمس، كان ذلك أفضل. جمع البيانات في تيار من غاز النيتروجين عند 100 ك. ملاحظة: تم الحصول عليها هذه البيانات في مصدر الضوء الماس (DLS) منشأة العلوم السنكروترون الوطني في المملكة المتحدة. تحليل البيانات عن طريق تقدير شدة انعكاس مع xia2 باستخدام كل MOSFLM 22 و XDS حزم 23، ومن ثم توسيع نطاق البيانات مع SCALA أو بلا هدف (24) وحزمة CCP4 25. حل الهياكل مع استبدال الجزيئي باستخدام PHASER 26. ضبط النموذج مع أبله 27 و صقل النموذج مع REFMAC5 28. إعداد رسوم بيانية مع PYMOL 29. حساب الاتصالات باستخدام "الاتصال"برنامج في حزمة CCP4. استخدام 4 قطع الامدادات عن فان دير فال الاتصالات و3.4 Å قطع للروابط هيدروجينية والجسور الملح. حساب التكامل سطح باستخدام برنامج "SC" في حزمة CCP4. حساب زاوية عبور مجمع TCR-pHLA، كما هو موضح 30. ملاحظة: للحصول على هذه الدراسة، تم إيداع البيانات انعكاس والإحداثيات نموذج النهائية مع قاعدة البيانات PDB (PMEL17 TCR-A2-YLE-9V فوسفات: 5EU6، A2-YLE PDB: 5EU3، A2-مط-3A PDB: 5EU4، وA2 -YLE-5A PDB: 5EU5).

Representative Results

استخدام الأساليب المذكورة أعلاه، ولدت لنا TCR للذوبان (الجدول 1) والجزيئات pHLA لإجراء تحليلات متعمقة الجزيئية الاعتراف GP100 280-288 قبل خلايا CD8 + T. تم استخدام E. نظام التعبير القولونية المعدلة لتوليد غير قابلة للذوبان وسطاء لكل سلسلة منفصلة من كل من TCRs (α و β سلاسل) وpHLAs (سلسلة α و β2m). هذا الأسلوب له ميزة كونها رخيصة نسبيا وسهلة لإنشاء ويولد عائدات كبيرة من البروتين (100-500 ملغم / لتر للثقافة). أيضا، فإن البروتينات غير قابلة للذوبان في حالة مستقرة للغاية إذا المخزنة في -80 درجة مئوية. نحن ثم استخدم refolding وتنقية تقنية راسخة لتوليد الوظائف، متجانسة، بروتينات قابلة للذوبان. هذه الطريقة مفيدة لتوليد البروتينات للتجارب الفيزيائية الحيوية والهيكلية، والخلوية، وكذلك المواد الكيميائية التي يمكن أن تستخدم لتشخيص أو العلاجات. <p class="jove_content" fo:keep-together.within الصفحات = "1"> هنا، استخدمنا هذه البروتينات لأداء ألانين تجارب الطفرات المسح الضوئي عبر العمود الفقري الببتيد وتقييمها TCR تقارب ملزمة باستخدام مأكل سطح الرنين (SPR) تجارب (الجدول 2). وكان هذا الاختبار أثبت التي المخلفات في الببتيد أهم لTCR ملزمة. يحلل عالية الدقة من الانتماءات الملزمة باستخدام هذه التقنية مفيدة للغاية لتحديد الآليات البيولوجية التي تتحكم في تفاعلات البروتين البروتين، وكذلك لتحليل تقارب ملزمة من الجزيئات العلاجية. نحن ثم تبلورت على بعد سرطان الجلد محددة قابلة للذوبان TCR (PMEL17 TCR) في مجمع مع pHLA المستمدة الورم المعدلة (A2-مط-9V) للتحقيق في وضع ملزم في قرار الذري (الشكلان 1 و 2 والجدول 3). وتوفر هذه التجارب رؤية مباشرة من واجهة ربط بين جزيئين، providinز المعلومات الأساسية حول المبادئ الأساسية التي تحكم التفاعل. أجرينا كذلك تحليل الحرارية من التفاعل باستخدام كل SPR ومركز التجارة الدولية، وكشف عن المساهمات النشطة التي مكنت ملزمة (الشكلان 3). وتم دعم هذه التحليلات أبعد من ذلك وصفا عالية الدقة من البصمة اتصال بين اثنين من البروتينات (الشكل 4 والجدول 4). نحن ثم حل هياكل جزيئات pHLA unligated، وتقديم أشكال متحولة من الببتيد، وكشف عن أن التحول الجزيئي يمكن أن يفسر لماذا بعض الطفرات ألغى TCR ملزمة (الشكلان 5). عموما، وفرت هذه التقنيات بيانات جديدة مما يدل على آلية شرح كيفية تعترف خلايا T مستضد المستمدة من سرطان الجلد وهذا هو هدف هام للعلاجات المضادة للسرطان. وعلى نطاق أوسع، هذه التقنياتيمكن استخدامها لتحقيق عمليا أي تفاعل مستقبلات يجند، كشف الآليات البيولوجية الجديدة التي قد تستهدف لتقدم علاجية جديدة. الشكل 1: الكثافة تحليل مؤامرة. يظهر العمود الأيسر حذفت الخرائط التي تم تنقيح هذا النموذج في غياب الببتيد. احيط كثافة الفرق عند 3.0 سيغما، وتظهر ملامح إيجابية باللون الأخضر، وملامح السلبية والأحمر. ويبين العمود الأيسر خريطة الملحوظة عند 1.0 سيغما (كما هو موضح شبكة الرمادية حول تمثيل عصا من سلاسل البروتين) بعد الصقل لاحقا باستخدام آلية القيود التماثل غير البلورات التي تطبقها REFMAC5. (أ) نموذج لPMEL17 TCR-A2-مط-9V مع TCR CDR3 حلقات زرقاء اللون (سلسلة α) والبرتقال (سلسلة β) والببتيد باللون الأخضر. (ب) نموذج لA2-YLE معالببتيد ملونة خضراء داكنة. (ج) نموذج لA2-مط-3A مع اللون البرتقالي الببتيد (لA2-مط-3A، هناك 2 الجزيئات في وحدة غير متكافئة، ولكن هذه كانت متطابقة تقريبا من حيث احذف وكثافة خرائط، لذلك نسخ فقط 1 ويظهر هنا). (د) نموذج لA2-مط-5A مع الببتيد الملونة الوردي. أعيد طبعها بإذن من المرجع 31. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: نظرة عامة على PMEL17 TCR في مجمع مع A2-YLE-9V. تمثيل (A) كارتون من مجمع PMEL17 TCR-A2-YLE-9V. والملونة TCR الأسود. وتظهر الحلقات TCR مجلس الإنماء والإعمار (أحمر، CDR1α، الأخضر الداكن، CDR2α، الأزرق، CDR3α، الأصفر، CDR1β، أكوا، CDR2 ^6 ؛؛ البرتقال، CDR3β)؛ وHLA-A * 0201 هو مبين في الرمادي. ويمثل الببتيد YLE-9V بواسطة العصي الخضراء. (ب) المياه السطحية والتمسك تمثيل مخلفات PMEL17 TCR مجلس الإنماء والإعمار حلقات (ترميز الألوان كما في أ) أن الاتصال سطح A2-مط (A2، الرمادية، YLE-9V والعصي الخضراء). خط مائل الأسود يشير إلى زاوية عبور TCR فيما يتعلق المحور الطويل للالببتيد YLEPGPVTV (46.15 °). (ج) الاتصال البصمة من TCR PMEL17 على سطح A2-YLE-9V (A2، رمادي)؛ الأرجواني والأخضر (السطحية والعصي) تشير إلى HLA-A * 0201 والمخلفات YLE، على التوالي، اتصل قبل TCR GP100. قطع من 3.4 Å على السندات الهيدروجين و 4 Å لفان دير فال الاتصالات. أعيد طبعها بإذن من المرجع 31. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alر = "الشكل 3" src = "/ ملفات / ftp_upload / 54991 / 54991fig3.jpg" /> الشكل 3: تحليل الديناميكا الحرارية من PMEL17 التفاعل TCR-A2-مط. (A) PMEL17 TCR الردود على A2-YLE في 5 و 12 و 18 و 25 ملزمة التوازن، و 37 درجة مئوية في تسع الى عشر التخفيفات المسلسل TCR. SPR البيانات الخام والمجهزة (على افتراض 1: 1 انجميور ملزمة) وترد في أقحم كل منحنى واستخدمت لحساب K على وK من القيم باستخدام خوارزمية العالمية لصالح (BIAevaluation 3.1). ويبين الجدول ملزم المتوازن لل(K D (E)) وثوابت ملزمة الحركية (K D (K) = K قبالة / K على) في كل درجة الحرارة. (، K D ميكرومتر) حسبت التوازن ملزمة المستمر القيم باستخدام نوبة غير الخطية (ص = (P1x) / (P2 + س)). حسبت (ب) المعلمات الحرارية وفقا للمعادلة جيبس-هيلمهولتز (ΔG ° = ΔH ° – TΔS درجة). طاقات حرة ملزمة، ΔG درجة (ΔG ° = -RTlnK D) تم التخطيط، ضد الحرارة (K) باستخدام الانحدار غير الخطية لتناسب المعادلة ثلاثة معلمة (ذ = ΔH ° + ΔCp ° * (س 298) -x * ΔS ° -x * ΔCp ° * قانون الجنسية (خ / 298)). المحتوى الحراري (ΔH °) والكون (TΔS درجة) على 298 K (25 درجة مئوية) وترد في كيلو كالوري / مول وحسبت من قبل الانحدار غير الخطي للحرارة (K) تآمر ضد الطاقة الحرة (ΔG درجة). (C) متساوي المعايرة المسعرية (ITC) القياسات لPMEL17 التفاعل TCR-A2-مط. يتم عرض المحتوى الحراري (ΔH °) والكون (TΔS درجة) على 298 K (25 درجة مئوية) في كيلو كالوري / مول. أعيد طبعها بإذن من المرجع 31. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <str أونج> الشكل 4: PMEL17 مجلس الإنماء والإعمار حلقات التركيز على الببتيد بقايا PRO4، Val7، وThr8. (أ) تمثيل تخطيطي للاتصالات بين الببتيد YLE-9V وبقايا حلقة PMEL17 مجلس الإنماء والإعمار (مرمزة كما في الشكل 2A). الأرقام في الجزء السفلي من لوحة تظهر مجموع الاتصالات بين TCR والببتيد. (ب) اتصالات بين PMEL17 TCR والببتيد YLE-9V (العصي الخضراء) تبين فان دير الاتصالات فال (أسود الخطوط المتقطعة)، والسندات الهيدروجين (الحمراء الخطوط المتقطعة) التي قدمها TCR CDR3α (الأزرق)، CDR1β (أصفر) ، CDR2β (أكوا)، وCDR3β (برتقالي) حلقات. في اللوحة السفلى هو وجهة نظر قريبة من الاتصالات بين YLE PRO4، Val7، وThr8، على التوالي، وTCR مجلس الإنماء والإعمار بقايا حلقة (العصي مرمزة كما في الشكل 1A). قطع من 3.4 Å على السندات الهيدروجين و 4 Å لفان دير فال الاتصالات. أعيد طبعها بإذن من المرجع 31.rge.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 5: مقارنة بتكوين جزئي للYLE، YLE-3A، وA2-YLE-5A الببتيدات قدمها HLA-A * 0201. (A) YLE (العصي خضراء داكنة) وYLE-3A (العصي البرتقال) الببتيد المواءمة عن طريق تركيب HLA-A * 0201 α1 الحلزون (الكرتون الرمادي). وتشير بقايا محاصر تحور Glu3 إلى ألانين. تظهر الأشكال كيف يسبب استبدال Glu3Ala تحولا في موقف (السهم الأسود) من PRO4 جار بقايا في بنية A2-YLE-3A مقارنة مع هيكل A2-مط. (ب) YLE (العصي خضراء داكنة) وYLE-5A (العصي الوردي) الببتيد المواءمة عن طريق تركيب HLA-A * 0201 α1 الحلزون (الكرتون الرمادي). وتشير بقايا محاصر تحور الجلايسين 5 إلى ألانين. أعيد طبعها بإذن من المرجع <sup> 31. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. TCR CDR1α CDR2α CDR3α CDR1β CDR1β CDR1β PMEL17 DSAIYN IQSSQRE CAVLSSGGSNYKLTFG SGHTA FQGTGA CASSFIGGTDTQYFG GP100 TSINN IRSNERE CATDGDTPLVFG LNHDA SQIVND CASSIGGPYEQYFG <strأونج> MPD KALYS LLKGGEQ CGTETNTGNQFYFG SGHDY FNNNVP CASSLGRYNEQFFG 296 DSASNY IRSNVGE CAASTSGGTSYGKLTFG MNHEY SMNVEV CASSLGSSYEQYFG الجدول 1: محاذاة TCR المناطق CDR3 من PMEL17، GP100، MPD، و 296 TCRs-GP100 محددة. أعيد طبعها بإذن من المرجع 31. تسلسل الببتيد الببتيد PMEL17 TCR TRAV21 TRBV7-3 الانجذاب K D GP100 TCR TRAV17 TRBV19 افىNITY K D YLEPGPVTA YLE 7.6 ± 2 ميكرومتر 26.5 ± 2.3 ميكرومتر YLEPGPVT الخامس YLE-9V 6.3 ± 1.2 ميكرومتر 21.9 ± 2.4 ميكرومتر وLEPGPVTA YLE-1A 15.9 ± 4.1 ميكرومتر 60.6 ± 5.4 ميكرومتر YL وPGPVTA YLE-3A لا ملزم لا ملزم YLE وGPVTA YLE-4A 19.7 ± 1.3 ميكرومتر 144.1 ± 7.8 ميكرومتر YLEP وPVTA YLE-5A > 1 ملم > 1MM YLEPG وVTA YLE-6A 11.4 ± 2.7 ميكرومتر 954.9 ± 97.8 ميكرومتر </tص> YLEPGP وTA YLE-7A 31.1 ± 4 ميكرومتر 102.0 ± 9.2 ميكرومتر YLEPGPV أ أ YLE-8A 38.1 ± 7.4 ميكرومتر 121.0 ± 7.5 ميكرومتر الجدول 2: تحليل تقارب (K د) من PMEL17 TCR وTCR GP100 GP100 إلى 280-288 المتغيرات الببتيد. أعيد طبعها بإذن من المرجع 31. المعلمات PMEL17 TCR-A2-YLE-9V A2-YLE A2-YLE-3A A2-YLE-5A كود PDB </قوي> 5EU6 5EU3 5EU4 5EU5 إحصاءات بيانات مجموعة الفضاء P1 P1 21 1 P1 P1 21 1 المعلمات الخلية وحدة (أ) و= 45.52، ب = 54.41، ج = 112.12، و= 85.0 درجة، ب = 81.6 درجة، ز = 72.6 ° و= 52.81، ب = 80.37، ج = 56.06، ب = 112.8 ° و= 56.08، ب = 57.63، ج = 79.93، و= 90.0 درجة، ب = 89.8 درجة، ز = 63.8 ° و= 56.33، ب = 79.64، ج = 57.74، ب = 116.2 ° مصدر الإشعاع DIAMOND I03 DIAMOND I03 DIAMOND I02 DIAMOND I02 الطول الموجي (أ) 0.9763 0.9999 0.9763 0.9763 قنينةمجموعة قرار الأحمر (أ) 51،87-2،02 45،25-1،97 43،39-2،12 43،42-1،54 قرار الخارجي شل (أ) 2،07-2،02 2،02-1،97 2،18-2،12 1،58-154 لاحظ انعكاس 128191 (8955) 99442 (7056) 99386 (7463) 244577 (17745) تأملات فريدة من نوعها 64983 (4785) 30103 (2249) 49667 (3636) 67308 (4962) كمال (٪) 97.7 (96.7) 98.5 (99.3) 97.4 (96.7) 99.6 (99.9) تعددية 2.0 (1.9) 3.3 (3.1) 2.0 (2.1) 3.6 (3.6) I / سيجما (I) 5.5 (1.9) 7.2 (1.9) 6.7 (20.3) 13 (2.3) Rpim (٪) 5.7 (39.8) 8.8 (44.7) 8.7 (41.6) 4.5 (35.4) دمج R (٪) 7.8 (39.6) 9.8 (50.2) 8.7 (41.6) 5.0 (53.2) إحصاءات الصقل القرار (أ) 2.02 1.97 2.12 1.54 لا انعكاسات المستخدمة 61688 28557 47153 63875 لا انعكاس في مجموعة Rfree 3294 1526 2514 3406 R cryst (لا قطع) (٪) 18.1 19.7 17.2 17.0 R مجانا 22.2 25.5 210.1 20.1 جذر متوسط الانحراف مربع من الهندسة المثالية طول الرابطة (أ) 0.018 (0.019) * 0.019 (0.019) * 0.021 (0.019) * 0.018 (0.019) * زوايا السندات (درجة) 1،964 (1،939) * 1،961 (1،926) * 2،067 (1،927) * 1،914 (1،936) * عموما تنسيق خطأ (أ) 0.122 0.153 0،147 0،055 راماشاندران الاحصائيات معظم تفضيلا 791 (96٪) 371 (98٪) 749 (99٪) 384 (98٪) سمح 32 (4٪) 6 (2٪) 10 (1٪) 5 (1٪) القيم المتطرفة 2 (0٪) 3 (1٪) 1 (0٪) 2 (0٪) الجدول 3: الحد من البيانات وصقل الاحصائيات (استبدال الجزيئي). أعيد طبعها بإذن من المرجع 31. القيم بين قوسين هي لأعلى قرار قذيفة. هلا / الببتيد بقايا TCR بقايا رقم VDW (≤4Å) سندات H رقم (≤3.4Å) Gly62 αGly98 3 αSer99 1 Arg65 αSer99 2 <tد> Arg65 يا αAsn100 Nδ2 2 1 Arg65 NH1 βAsp58 Oδ2 1 βSer59 8 Lys66 αGly98 1 αSer99 4 αAsn100 4 Ala69 αAsn100 2 βAla56 2 Gln72 Nε2 βGln51 يا 3 1 βGly54 7 βAla55 1 <tد> Thr73 βGln51 1 Val76 βGln51 3 βGly52 2 Lys146 βPhe97 3 βIle98 3 Ala150 βIle98 1 βAsp102 3 Val152 βIle98 1 Glu154 αTyr32 1 Gln155 N αTyr32 OH 4 1 Gln155 Oε1 βThr101 N 10 1 <tص> Tyr1 OH αGly97 يا 1 1 αGly98 1 αSer96 1 Glu3 αTyr101 1 PRO4 αSer96 1 αSer99 1 αAsn100 4 PRO4 يا αTyr101 N 14 1 Gly5 αTyr101 3 βGly100 2 Val7 βIle98 7 βGly99 2 βGly100 2 Thr8 βThr31 5 βGln51 1 βPhe97 1 Thr8 N βIle98 يا 6 1 الجدول 4: PMEL17 TCR-A2-YLE-9V الاتصال الجدول. أعيد طبعها بإذن من المرجع 31.

Discussion

توفر البروتوكولات المذكورة هنا إطارا لتشريح الجزيئية والخلوية من الاستجابات تي خلية في سياق أي الأمراض التي تصيب البشر. على الرغم من أن سرطان كان التركيز الرئيسي لهذه الدراسة، وقد استخدمنا نهج مشابهة جدا لتحقيق استجابات الخلايا التائية للفيروسات 32، 33، 34، 35، 36، 37 وأثناء المناعة الذاتية 38، 39، 40. وعلاوة على ذلك، وقد استخدمنا هذه التقنيات على نطاق أوسع لفهم مبادئ الجزيئية التي تتحكم خلايا T مستضد الاعتراف 19، 41، 42. في الواقع، وطبيعة لا يمكن التنبؤ بها من تعديلات على الببتيد المخلفات، حتى تلك التيخارج من بقايا الاتصال TCR، والتعرف على الآثار تي خلية آثار هامة لتصميم الببتيدات heteroclitic. وقد ساهمت هذه النتائج مباشرة إلى تطوير علاجات رواية تي خلية، بما في ذلك اللقاحات الببتيد 6 و 43 و الاصطناعية TCRs عالية تقارب 20، 44، وكذلك من وسائل التشخيص المحسنة 45، 46، 47.

الخطوات الحاسمة في البروتوكول
جيل من البروتين النقي للغاية، وظيفية أمر ضروري لجميع الطرق الواردة في هذه الورقة.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
صعوبات في توليد البروتين النقي للغاية تتعلق غالبا للتعبير عن درجة عاليةالبحتة، غير قابلة للذوبان وسطاء من نظام التعبير كولاي. عادة، تعديل بروتوكول التعبير (على سبيل المثال، الأمر الذي أدى إلى كثافة بصرية مختلفة، وذلك باستخدام سلالات مختلفة كولاي، أو باستخدام تشكيلات وسائل الإعلام المختلفة) يحل هذه القضايا.

القيود المفروضة على تقنية
هذه التقنيات تستخدم جزيئات البروتين القابلة للذوبان (TCR وpHLA) التي يتم التعبير عنها عادة على سطح الخلية. وبالتالي، فمن المهم التأكد من أن النتائج الهيكلية / الفيزيائية الحيوية تتفق مع النهج الخلوية لتأكيد الأهمية البيولوجية.

أهمية هذه التقنية فيما يتعلق بأساليب الحالية / البديلة
من خلال استخدام البلورات بالأشعة السينية والفيزياء الحيوية إثباتها من خلال التحليل الوظيفي، نحن وغيرنا قد أظهرت أن TCRs محددة لالحواتم السرطان تتميز عموما الانتماءات الملزمة منخفضة 48. هذا المنخفض TCR تقارب قد تساعد في تفسير سبب ع خلايا Tالبريد يست فعالة بشكل طبيعي في إزالة السرطان. هياكل عالية الدقة الذرية المجمعات بين TCRs المضادة للسرطان ومستضدات الأورام وما شابه ذلك بدأت تكشف عن الأساس الجزيئي لهذا التقارب الضعيف. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الدراسات هي مفيدة لتحديد الآليات التي تكمن وراء التدخلات العلاجية المصممة للتغلب على هذه المشكلة، بذر تحسينات في المستقبل 16. في هذه الدراسة، درسنا هيكل الأول من αβTCR التي تحدث بشكل طبيعي في مجمع مع GP100 HLA-A * 0201 المقيدة سرطان الجلد حاتمة. هيكل، جنبا إلى جنب مع دراسة الفيزياء الحيوية في العمق، كشف وضع ملزم العام للتفاعل. نحن أيضا كشفت تبديل غير متوقع الجزيئية، التي وقعت في شكل تحور من الببتيد، التي تلغي TCR ملزمة (تقييمها باستخدام سطح صدى مأكل) وCD8 + T الاعتراف خلايا (التجارب الوظيفية). كان من الممكن فقط لإثبات هذه الآلية الجديدة من presentati المستضد HLAعلى استخدام وسائل عالية الدقة وصفها.

التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات بعد اتقان هذه التقنية
وعموما، نتائجنا تظهر قوة البلورات بالأشعة السينية وطرق الفيزيائية الحيوية عند دمجها مع تحليلات وظيفية قوية. باستخدام هذه الأساليب، فمن الممكن أن تشريح خارج الآليات الجزيئية الدقيقة التي تحكم الاعتراف مستضد الخلايا التائية. والواقع أنه من الممكن أيضا استخدام هذا النهج إلى حل هيكل unligated TCRs، مما يدل على مدى التغييرات متعلق بتكوين يمكن أن تلعب دورا خلال التمييز المستضد 49، 50، 51. لديه فهم أفضل للطبيعة المعقدة للغاية والحيوية التي تقوم عليها التفاعلات TCR-pHLA أيضا آثار واضحة لتصميم العلاج. أن تكون قادرة على مباشرة "رؤية" الجزيئات التي مستهدفون علاجيا، فضلا عن تأثير تلك التعديلات لها على recognitio مستضدن، وتحسين واضح في تطوير هذه الأدوية للمضي قدما. في هذه الدراسة، وتبين لنا أنه حتى التغييرات في بقايا الببتيد واحدة لا تعمل بشكل كبير من قبل TCR يمكن أن تنقل غير متوقع تغييرات هيكلية على المخلفات الأخرى في الببتيد محددة HLA، والتي، بدورها، يغير بشكل كبير الاعتراف تي خلية. وهناك فهم أكثر اكتمالا من الآليات الجزيئية المستخدمة خلال الاعتراف مستضد الخلايا التائية يكون مفيدا بشكل كبير عند تصميم العلاجات المستقبلية لمجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويدعم BM قبل دراسية لبحوث السرطان في بريطانيا الدكتوراه. ويدعم AG قبل دراسية لايف ساينس شبكة البحوث ويلز الدكتوراه. ويدعم VB من قبل دراسية لأبحاث السرطان ويلز الدكتوراه. DKC هو مؤسسة أبحاث زميل التطوير الوظيفي ويلكوم (WT095767). AKS غير محقق ويلكوم ترست. ويتم تمويل GHM من قبل مشتركة شبكة بحوث علوم الحياة ويلز وTenovus رعاية مرضى السرطان دكتوراه دراسية ل. ونحن نشكر الموظفين في الماس مصدر الضوء لتقديم التسهيلات والدعم.

Materials

S.O.C. media Invitrogen
Orbi-Safe New Orbit incubator Sanyo
carbenicillin  Sigma
IPTG  Fisher
Quick Coomassie Stain SafeStain  Generon
Legend RT centrifuge  Sorvall
Tris  Fisher
magnesium chloride  Arcos
NaCl  Fisher
glycerol  Sigma-Aldrich
Sonopuls HD 2070  Bandelin
DNAse  Fisher
Triton Sigma-Aldrich
EDTA  Fisher
guanidine  Fisher
NanoDrop ND1000  Thermo
Peptides Peptide Protein Research
dithiothreitol  Sigma-Aldrich
L-arginine  SAFC
cysteamine  Fisher
cystamine  Fisher
dialysis tubing  Sigma-Aldrich
urea  Sigma-Aldrich
Metricel 0.45 μm membrane filter Pall
POROS 10/100 HQ  Applied biosystems
ÄKTA pure FPLC system  GE Healthcare Life Sciences
10 kDa MWCO Vivaspin 20  Sartorius
10 kDa MWCO Vivaspin 4  Sartorius
Superdex 200 10/300 GL column  GE Healthcare Life Sciences
Phosphate Buffer Saline  Oxoid
BIAcore buffer HBS  GE Healthcare Life Sciences
Biotinylation kit Avidity
BIAcore T200 GE Healthcare Life Sciences
CM5 chip coupling kit GE Healthcare Life Sciences
streptavidin  Sigma-Aldrich
Microcal VP-ITC  GE Healthcare Life Sciences
Hepes  Sigma-Aldrich
Gryphon crystallisation robot Art Robbins Instruments
Intelli-plate  Art Robbins Instruments
Crystallisation screens and reagents Molecular Dimensions
75 cm2 flask  Greiner Bio-One
0.22 μm filters Miller-GP, Millipore
Ultra-Clear ultracentrifuge tube  Beckman Coulter
Optima L-100 XP with SW28 rotor Beckman Coulter
CD8 microbeads  Miltenyi Biotec
anti-CD3/CD28 Dynabeads  Invitrogen
anti-PE microbeads  Miltenyi Biotec
CK medium, PHA Alere Ltd
anti-TCRVβ mAb  BD
dasatinib  Axon
MIP-1β and TNFα ELISA  R&D Systems
 51Cr  PerkinElmer
1450 Microbeta counter PerkinElmer

References

  1. Aleksic, M., Liddy, N., et al. Different affinity windows for virus and cancer-specific T-cell receptors: implications for therapeutic strategies. European journal of immunology. 42 (12), 3174-3179 (2012).
  2. Cole, D. K., Pumphrey, N. J., et al. Human TCR-binding affinity is governed by MHC class restriction. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 178 (9), 5727-5734 (2007).
  3. Cole, D. K., Sami, M., et al. Increased Peptide Contacts Govern High Affinity Binding of a Modified TCR Whilst Maintaining a Native pMHC Docking Mode. Frontiers in immunology. 4 (JUN), 168 (2013).
  4. Raman, M. C. C., Rizkallah, P. J., et al. Direct molecular mimicry enables off-target cardiovascular toxicity by an enhanced affinity TCR designed for cancer immunotherapy. Scientific reports. 6, 18851 (2016).
  5. Liddy, N., Bossi, G., et al. Monoclonal TCR-redirected tumor cell killing. Nature medicine. 18 (6), 980-987 (2012).
  6. Cole, D. K., Edwards, E. S. J., et al. Modification of MHC anchor residues generates heteroclitic peptides that alter TCR binding and T cell recognition. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 185 (4), 2600-2610 (2010).
  7. Parkhurst, M. R., Salgaller, M. L., et al. Improved induction of melanoma-reactive CTL with peptides from the melanoma antigen gp100 modified at HLA-A*0201-binding residues. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 157 (6), 2539-2548 (1996).
  8. Salgaller, M. L., Marincola, F. M., Cormier, J. N., Rosenberg, S. A. Immunization against epitopes in the human melanoma antigen gp100 following patient immunization with synthetic peptides. Cancer research. 56 (20), 4749-4757 (1996).
  9. Cameron, B. J., Gerry, A. B., et al. Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells. Science translational medicine. 5 (197), 197ra103 (2013).
  10. Linette, G. P., Stadtmauer, E. A., et al. Cardiovascular toxicity and titin cross-reactivity of affinity-enhanced T cells in myeloma and melanoma. Blood. 122 (6), 863-871 (2013).
  11. Miles, K. M., Miles, J. J., Madura, F., Sewell, A. K., Cole, D. K. Real time detection of peptide-MHC dissociation reveals that improvement of primary MHC-binding residues can have a minimal, or no, effect on stability. Molecular immunology. 48 (4), 728-732 (2011).
  12. Lesterhuis, W. J., Schreibelt, G., et al. Wild-type and modified gp100 peptide-pulsed dendritic cell vaccination of advanced melanoma patients can lead to long-term clinical responses independent of the peptide used. Cancer immunology, immunotherapy CII. 60 (2), 249-260 (2011).
  13. Speiser, D. E., Baumgaertner, P., et al. Unmodified self antigen triggers human CD8 T cells with stronger tumor reactivity than altered antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (10), 3849-3854 (2008).
  14. Schaft, N., Willemsen, R. A., et al. Peptide fine specificity of anti-glycoprotein 100 CTL is preserved following transfer of engineered TCR alpha beta genes into primary human T lymphocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 170 (4), 2186-2194 (2003).
  15. Schaft, N., Coccoris, M., et al. An Altered gp100 Peptide Ligand with Decreased Binding by TCR and CD8α Dissects T Cell Cytotoxicity from Production of Cytokines and Activation of NFAT. Frontiers in immunology. 4 (SEP), 270 (2013).
  16. Madura, F., Rizkallah, P. J., et al. Structural basis for ineffective T-cell responses to MHC anchor residue-improved "heteroclitic" peptides. European journal of immunology. 45 (2), 584-591 (2015).
  17. Boulter, J. M., Glick, M., et al. Stable, soluble T-cell receptor molecules for crystallization and therapeutics. Protein engineering. 16 (9), 707-711 (2003).
  18. Garboczi, D. N., Utz, U., et al. Assembly, specific binding, and crystallization of a human TCR-alphabeta with an antigenic Tax peptide from human T lymphotropic virus type 1 and the class I MHC molecule HLA-A2. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 157 (12), 5403-5410 (1996).
  19. Madura, F., Rizkallah, P. J., et al. T-cell receptor specificity maintained by altered thermodynamics. Journal of Biological Chemistry. 288 (26), 18766-18775 (2013).
  20. Cole, D. K., Rizkallah, P. J., et al. Computational design and crystal structure of an enhanced affinity mutant human CD8 alphaalpha coreceptor. Proteins: Structure, Function and Genetics. 67 (1), 65-74 (2007).
  21. Benvenuti, M., Mangani, S. Crystallization of soluble proteins in vapor diffusion for x-ray crystallography. Nature protocols. 2 (7), 1633-1651 (2007).
  22. Leslie, A. G. W., Powell, H. R., et al. Automation of the collection and processing of X-ray diffraction data – a generic approach. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (11), 1924-1928 (2002).
  23. Kabsch, W. Xds. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  24. Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution?. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).
  25. Bailey, S. N. The CCP4 suite: Programs for protein crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (5), 760-763 (1994).
  26. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  27. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 60 (12 I), 2126-2132 (2004).
  28. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 53 (3), 240-255 (1997).
  29. Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How Tcrs Bind Mhcs, Peptides, and Coreceptors. Annual Review of Immunology. 24 (1), 419-466 (2006).
  30. Bianchi, V., Bulek, A., et al. A Molecular Switch Abrogates Glycoprotein 100 (gp100) T-cell Receptor (TCR) Targeting of a Human Melanoma Antigen. Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8951-8959 (2016).
  31. Matthews, P. C., Koyanagi, M., et al. Differential clade-specific HLA-B*3501 association with HIV-1 disease outcome is linked to immunogenicity of a single Gag epitope. Journal of virology. 86 (23), 12643-12654 (2012).
  32. Gostick, E., Cole, D. K., et al. Functional and biophysical characterization of an HLA-A* 6801-restricted HIV-specific T cell receptor. European Journal of Immunology. 37 (2), 479-486 (2007).
  33. Miles, J. J., Bulek, A. M., et al. Genetic and structural basis for selection of a ubiquitous T cell receptor deployed in Epstein-Barr virus infection. PLoS Pathogens. 6 (11), e1001198 (2010).
  34. Holland, C. J., Rizkallah, P. J., et al. Minimal conformational plasticity enables TCR cross-reactivity to different MHC class II heterodimers. Scientific reports. 2, 629 (2012).
  35. Kløverpris, H. N., Cole, D. K., et al. A molecular switch in immunodominant HIV-1-specific CD8 T-cell epitopes shapes differential HLA-restricted escape. Retrovirology. 12, 20 (2015).
  36. Motozono, C., Kuse, N., et al. Molecular Basis of a Dominant T Cell Response to an HIV Reverse Transcriptase 8-mer Epitope Presented by the Protective Allele HLA-B*51:01. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 192 (7), 3428-3434 (2014).
  37. Motozono, C., Pearson, J. A., et al. Distortion of the major histocompatibility complex class i binding groove to accommodate an insulin-derived 10-mer peptide. Journal of Biological Chemistry. 290 (31), 18924-18933 (2015).
  38. Cole, D. K., Bulek, A. M., et al. Hotspot autoimmune T cell receptor binding underlies pathogen and insulin peptide cross-reactivity. The Journal of clinical investigation. , (2016).
  39. Bulek, A. M., Cole, D. K., et al. Structural basis for the killing of human beta cells by CD8(+) T cells in type 1 diabetes. Nature immunology. 13 (3), 283-289 (2012).
  40. Ekeruche-Makinde, J., Clement, M., et al. T-cell receptor-optimized peptide skewing of the T-cell repertoire can enhance antigen targeting. Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37269-37281 (2012).
  41. Cole, D. K., Miles, K. M., et al. T-cell Receptor (TCR)-peptide specificity overrides affinity-enhancing TCR-major histocompatibility complex interactions. Journal of Biological Chemistry. 289 (2), 628-638 (2014).
  42. Cole, D. K., Gallagher, K., et al. Modification of the carboxy-terminal flanking region of a universal influenza epitope alters CD4+ T-cell repertoire selection. Nature communications. 3, 665 (2012).
  43. Varela-Rohena, A., Molloy, P. E., et al. Control of HIV-1 immune escape by CD8 T cells expressing enhanced T-cell receptor. Nature medicine. 14 (12), 1390-1395 (2008).
  44. Holland, C. J., Dolton, G., et al. Enhanced Detection of Antigen-Specific CD4+ T Cells Using Altered Peptide Flanking Residue Peptide-MHC Class II Multimers. The Journal of Immunology. 195 (12), 5827-5836 (2015).
  45. Wooldridge, L., Clement, M., et al. MHC class I molecules with Superenhanced CD8 binding properties bypass the requirement for cognate TCR recognition and nonspecifically activate CTLs. Journal of immunology (Baltimore, Md: 1950). 184 (7), 3357-3366 (2010).
  46. Laugel, B., Den Berg, H. A. V. a. n., et al. Different T cell receptor affinity thresholds and CD8 coreceptor dependence govern cytotoxic T lymphocyte activation and tetramer binding properties. Journal of Biological Chemistry. 282 (33), 23799-23810 (2007).
  47. Bridgeman, J. S., Sewell, A. K., Miles, J. J., Price, D. A., Cole, D. K. Structural and biophysical determinants of αβ T-cell antigen recognition. Immunology. 135 (1), 9-18 (2012).
  48. Willcox, B. E., Gao, G. F., et al. TCR binding to peptide-MHC stabilizes a flexible recognition interface. Immunity. 10 (3), 357-365 (1999).
  49. Borbulevych, O. Y., Piepenbrink, K. H., Baker, B. M. Conformational melding permits a conserved binding geometry in TCR recognition of foreign and self molecular mimics. Journal of immunology (Baltimore, Md: 1950). 186 (5), 2950-2958 (2011).
  50. Armstrong, K. M., Piepenbrink, K. H., Baker, B. M. Conformational changes and flexibility in T-cell receptor recognition of peptide-MHC complexes. The Biochemical journal. 415 (2), 183-196 (2008).

Play Video

Citer Cet Article
MacLachlan, B. J., Greenshields-Watson, A., Mason, G. H., Schauenburg, A. J., Bianchi, V., Rizkallah, P. J., Sewell, A. K., Fuller, A., Cole, D. K. Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens. J. Vis. Exp. (120), e54991, doi:10.3791/54991 (2017).

View Video