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Immunologie et infection

Utilizzando cristallografia a raggi X, Biofisica, e saggi funzionali per determinare i meccanismi di amministrazione delle cellule T del recettore Riconoscimento di cancro antigeni

Published: February 06, 2017
doi:
10.3791/54991
, , , , , , , ,
1Division of Infection and Immunity and Systems Immunity Research Institute,Cardiff University, 2Department of Oncology,University Hospital of Lausanne (CHUV), 3Ludwig Insitutue for Cancer Research, Lausanne Branch,University of Lausanne

Summary

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

Abstract

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Introduction

Cristallografia a raggi X è stata e continuerà ad essere, una tecnica estremamente potente per comprendere la natura delle interazioni ligando-recettore. Visualizzando queste interazioni in dettaglio atomico, non solo è possibile divulgare i meccanismi molecolari che regolano molti processi biologici, ma è anche possibile modificare direttamente interfacce contatti beneficio terapeutico. Accoppiato con tecniche come la risonanza plasmonica di superficie e Calorimetria isotermica di titolazione (solo per citarne un paio), tali modifiche possono poi essere analizzati biofisico, per valutare l'impatto diretto sulla affinità di legame, cinetiche di interazione, e la termodinamica. Infine, effettuando esperimenti funzionali in tipi di cellule interessate, un quadro dettagliato dell'impatto molecolare e funzionale delle modifiche alle interazioni recettore-ligando possono essere raccolte, fornendo informazioni molto specifiche meccanicistico. In generale, questi tipi di metodi forniscono un'immagine atomico risoluzione permettendo scoraggiare minazione di come i sistemi biologici lavorare, con implicazioni connesse per i progressi diagnostici e terapeutici.

Il nostro laboratorio utilizza abitualmente queste tecniche per studiare i recettori che mediano l'immunità umana a cellule T agli agenti patogeni e tumori, in autoimmunità, e durante il trapianto. Qui, ci concentriamo sulla risposta delle cellule T CD8 + umani al cancro, mediato da una interazione tra il recettore delle cellule T (TCR) e antigene leucocitario umano (HLA) peptidi tumorali derivate -restricted (Phla). Questo è importante perché, anche se le cellule T CD8 + sono in grado di indirizzare le cellule tumorali, noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato che TCR anti-cancro subottimale si legano alla loro Phla cognate 1, 2. Così, molti laboratori hanno tentato di alterare sia il TCR 3, 4, 5 o il ligando peptide 6,class = "xref"> 7, 8 per aumentare l'immunogenicità e per meglio cellule tumorali bersaglio. Tuttavia, questi approcci non sono sempre efficaci e possono avere gravi effetti collaterali, tra cui fuori bersaglio tossicità 4, 9, 10. Ulteriori ricerche esplorando i meccanismi molecolari che regolano il riconoscimento delle cellule T di antigeni tumorali sarà fondamentale per superare queste carenze.

Nel presente studio, ci siamo concentrati sulle risposte contro le cellule di melanoma autologhe da cellule T CD8 + specifiche per un frammento dell'antigene differenziazione dei melanociti glicoproteina 100 (gp100), gp100 280-288, presentati da HLA-A * 0201 (il più comunemente -expressed classe Phla umana I). Questo antigene è stato un obiettivo ampiamente studiato per il melanoma immunoterapia ed è stato sviluppato come un cosiddetto peptide "eterocliti" in cui una valina sostituisce alaninain posizione di ancoraggio 9 per migliorare la stabilità Phla 11. Questo approccio è stato utilizzato per migliorare l'induzione di CTL melanoma-reattiva in vitro ed è stato usato con successo in studi clinici 12. Tuttavia, modifiche ai residui peptidici possono avere effetti imprevedibili sulla specificità delle cellule T, dimostra la scarsa efficacia della maggior parte dei peptidi heterolitic nella clinica 6, 13. Infatti, un'altra forma eterocliti di gp100 280-288, in cui i residui del peptide Glu3 sostituito da Ala, abrogata riconoscimento da parte di una popolazione policlonale di GP100 280-288 cellule T specifico d'14, 15. Abbiamo precedentemente dimostrato che anche piccoli cambiamenti nei residui del peptide di ancoraggio possono alterare in modo sostanziale il riconoscimento delle cellule T in modo imprevedibile 6, 16. Pertanto, lo studio ha analizzato costruireing un quadro più dettagliato di come le cellule T CD8 + riconoscono GP100 e come modifiche dell'interazione tra TCR e Phla potrebbe avere un impatto tale funzione.

Qui, abbiamo generato, forme solubili altamente pure di due TCR specifici per gp100 280-288 presentati da HLA-A * 0201 (A2-YLE), nonché le forme naturali e alterati di Phla. Questi reagenti sono stati utilizzati per generare cristalli di proteine ​​per risolvere la struttura atomica ternaria di un TCR umana in complesso con forma eterocliti di A2-YLE, nonché due dei pHLAs mutanti in forma unligated. Abbiamo poi utilizzato un approccio di scansione peptide per dimostrare l'impatto delle sostituzioni peptidici il TCR eseguendo approfondita esperimenti biofisici. Infine, abbiamo generato una linea di cellule T CD8 + geneticamente modificati, ri-programmati per esprimere uno dei TCR specifici A2-YLE-, per eseguire esperimenti funzionali per testare l'impatto biologico delle varie modifiche peptidici. Questi dati dimostrano che anche Modìfiche di peptide residui che si trovano al di fuori del motivo di legame TCR può avere imprevedibili effetti a catena sui residui peptidici adiacenti che abrogare vincolante TCR e il riconoscimento delle cellule T. I nostri risultati rappresentano il primo esempio dei meccanismi strutturali sottostanti riconoscimento cellule T di questo importante obiettivo terapeutico per il melanoma.

Protocol

1. Protein Expression Realizzare costrutti genici per la generazione di TCR solubili e pHLAs, come descritto in dettaglio in precedenza 17, 18. Progettare ciascuna costruzione con un 5 'BamH1 e 3' sito EcoR1 di restrizione per l'inserimento nel vettore pGMT7. Transform coli Rosetta (DE3) pLysS E. con un vettore plasmidico pGMT7 derivato contenente la sequenza codificante la proteina di interesse incubando 1 ml di 50-200 ng / ml plasmide con 5 ml di E.coli per 5 minuti a 4 ° C , 2 min a 42 ° C e 5 min a 4 ° C, e la piastra durante la notte a 37 ° C su una piastra di agar LB supplementato con 50 mg / L carbenicillina. Raccogliere singole colonie e crescere a 37 ° C e 220 rpm in 30 mL di TYP mezzi (16 g / L di triptone, 16 g / estratto di lievito L, e 5 g / L HK 2 O 4) integrato con 100 pM carbenicillina fino sospensione raggiunge un de otticansity (OD 600) compreso tra 0,4 e 0,6. Indurre la produzione di proteine ​​in un mL un'aliquota 5 con l'introduzione di 0,5 mm isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) per 3 ore. Mantenere 20 ml di sospensione con e senza induzione di elettroforesi gel di sodio dodecil solfato poliacrilammide (SDS-PAGE) analisi e macchiare il gel. Aggiungere colture starter a 1 L di TYP supplementato con 100 pM carbenicillina e crescere cellule come sopra descritto al punto 1.3 fino alla sospensione raggiunge un OD 600 tra 0,4 e 0,6. Indurre l'espressione di proteine ​​per 3 ore con 0,5 mM IPTG. Centrifugare le cellule per 20 min a 3000 xg e versare con cautela il surnatante. Sciogliere il pellet in 40 ml di tampone di lisi (10 mM Tris, pH 8,1; 10 mM cloruro di magnesio, MgCl 2; 150 mM NaCl e 10% glicerolo), ultrasuoni in ghiaccio per potere 30 min a 60% utilizzando un 2 s intervallo , e incubare a temperatura ambiente (RT) per 30 minuti con 0,1 g / L DNasi. Trattare il suspensione contenente le proteine ​​in forma di corpi di inclusione (IB) con 100 ml di tampone di lavaggio (0,5% Triton X-100; 50 mM Tris, pH 8,1, 100 mM NaCl e 10 mM EDTA). Centrifugare il campione per 20 minuti a 4 ° C e 8.000 xg e versare cautamente il surnatante. Risospendere il pellet in 100 ml di tampone risospensione (50 mM Tris, pH 8,1, 100 mM NaCl, e 10 mM EDTA, pH 8.1), centrifugare come prima a 8.000 xg, e versare con cautela il surnatante. Infine, sciogliere il precipitato in 10 ml di tampone guanidina (6 M guanidina; 50 mM Tris, pH 8,1, 2 mM EDTA, pH 8,1 e 100 mM NaCl) e misurare la concentrazione di proteine ​​a 280 nm utilizzando uno spettrofotometro. 2. Phla e TCR ripiegamento Per i ripiega Phla, miscelare 30 mg di HLA-A2 (o HLA-A2 con un tag biotina) IBs, 30 mg di β2m IBs e 4 mg di peptide per 30 minuti a 37 ° C in un bagno d'acqua in un volume finale 6 mL di tampone guanidina integrato con 10 mM ditiotreitolo(DIGITALE TERRESTRE). Avviare ripiegamento proteico diluendo la miscela precedente in 1 L di tampone HLA ripiegare pre-raffreddata (50 mM Tris, pH 8,1, 400 mM L-arginina, 2 mM EDTA, pH 8,1, 6 mM cisteamina e 4 mM cistamina). Lasciare l'HLA ripiegare agitazione a 4 ° C per 3 ore e poi trasferisce in un kDa MWCO 12,4 (peso molecolare cut-off) tubo di dialisi e Dializzare due volte per 24 ore contro 20 L di 10 mM Tris, pH 8,1. Per i ripiega TCR, miscelare 30 mg di TCR catena α IBS e 30 mg di TCR catena β IBs per 30 minuti a 37 ° C in un bagno d'acqua in 6 mL di tampone guanidina supplementato con 10 mM DTT. Avviare ripiegamento proteico diluendo la miscela denaturato TCR in 1 L di tampone pre-raffreddata TCR ripiegare (50 mM Tris, pH 8,1; 2,5 M urea, 2 mM EDTA, pH 8,1, 6 mM cisteamina e 4 mM cistamina) per 3 h. Trasferire il ripiegare in un tubo di dialisi 12,4 kDa MWCO e dializzare due volte per 24 ore contro 20 L di 10 mM Tris, pH 8,1. Filtrare sia il Phla o TCR refolds usando un filtro a membrana da 0,45 micron per le fasi di purificazione. 3. Purificazione da Fast Protein cromatografia liquida (FPLC) Caricare la preparazione refold filtrato (sia Phla o TCR) su un 7,9 mL, 50 um anionico colonna di resina a scambio pre-equilibrata con 20 ml di 10 mM Tris, pH 8.1 su un sistema di cromatografia flessibile ed intuitiva. Eluire la proteina a 5 mL / min con un gradiente salino (0-500 mM NaCl in 10 mM Tris, pH 8,1, su 8 volumi di colonna) e raccogliere frazioni da 1 ml. Analizzare le frazioni corrispondenti alla proteina di interesse mediante SDS-PAGE, raggruppare le frazioni contenenti la proteina di interesse insieme, e concentrarli fino a 500 microlitri con 10-kDa MWCO 20 o 10 kDa MWCO 4 mediante centrifugazione per 20 minuti a 4000 xg , scartando il flusso passante. Caricare i preparati proteici concentrati in un mL ciclo 2 iniezione su una colonna di cromatografia di esclusione 24 dimensione mL pre-equilibrata con l'applicazioneBuffer ropriate eluizione: tampone fosfato salino (PBS), HBS (10 mM HEPES, pH 7.4; 150 mM NaCl; 3,4 mM EDTA, e 0,005% di tensioattivo), o buffer di cristallo (10 mM Tris, pH 8,1, e 10 mM NaCl ). Eluire proteine ​​ad una portata di 0,5 ml / min oltre 1 colonna Volume; raccogliere 1 frazioni mL contenenti la proteina di interesse verificato per SDS-PAGE. NOTA: Questi metodi sono stati utilizzati per generare solubili PMEL17 TCR e GP100 TCR, così come tutti i pHLAs utilizzati in questo studio: HLA-A * 0201 con YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- 7A), o YLEPGPVAA (A2-YLE-8A). 4. risonanza plasmonica di superficie (SPR) Analisi Eseguire analisi dell'equilibrio vincolante o analisi termodinamica utilizzando un sistema di analisi interazioni molecolari dotato di CM5 chip del sensore 19. Attivare il chip CM5 da flowing 1: 1 miscela di 100 mM N-idrossisuccinimmide (NHS) e 400 mM 1-etil 3–(3-dimetilpropil) -carboiimide (EDC) per 10 minuti a una velocità di flusso di 10 ml / min ed a 25 ° C. Caricare circa 5.000 unità di risposta (RU) di streptavidina (110 ml di 200 mg / ml a 10 mM acetato, pH 4,5) per covalente collegano alla superficie del chip in tutti e quattro portate cellule e utilizzare 100 ml di 1 M etanolammina cloridrato per disattivare eventuali gruppi reattivi rimanenti. Coppia di circa 500-600 UR di Phla, a ~ 1 mM in tampone commerciale (fornito dal produttore), al chip sensore CM5 ad una portata lenta di 10 microlitri / min per assicurare una distribuzione uniforme sulla superficie del chip. Saturare la superficie del chip con 1 mM biotina in tampone commerciale (fornita dal produttore) per 60 s. Iniettare dieci diluizioni seriali di TCR solubili oltre pertinenti portate cellule ad una elevata portata di 30 microlitri / min a 25 ° C. Calcolare la costante di equilibrio vincolante(K D (E)) valori utilizzando una misura lineare curva (y = (P1x) / (P2 + x)) 20. NOTA: le unità y = risposta, x = concentrazione analista, P1 = r max, P2 = K D. Eseguire l'analisi cinetiche ipotizzando un 1: 1 Langmuir vincolante e adattare i dati utilizzando un algoritmo globale-fit nel pacchetto software 2. Eseguire termodinamica esperimenti ripetendo questo metodo alle seguenti temperature: 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C e 30 ° C 19. Utilizzare i valori K D determinati da SPR a temperature diverse per calcolare DeltaG ° utilizzando l'equazione termodinamico standard (DeltaG ° = -RTlnK D) 19. NOTA: R = costante dei gas, T = temperatura in K, ln = logaritmo naturale. Calcolare i parametri termodinamici secondo l'equazione di Gibbs-Helmholtz (DeltaG ° = d H – TΔS °) 19. </li> Tracciare le energie di legame liberi, DeltaG ° (DeltaG ° = -RTlnK D), contro temperatura (K) utilizzando una regressione non lineare per adattare l'equazione a tre parametri (y = d H + ΔCp * (x-298) -x * ΔS- x * ΔCp * ln (x / 298)) 19. NOTA: y = temperatura in K, x = DeltaG °. 5. Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) Effettuare esperimenti ITC utilizzando un calorimetro di titolazione isotermica. Iniettare 30 pM Phla nella cella del calorimetro e di carico 210 pM solubile TCR nella siringa. Utilizzare le seguenti condizioni tampone: 20 mm Hepes (pH 7,4) contenente 150 mM NaCl. Eseguire 20 iniezioni TCR, ciascuna di un volume 2 microlitri. Calcolare d H e K D utilizzando il software di analisi. 6. Cristallizzazione, raccolta dati di diffrazione, e modello Refinement Eseguire prove di cristallizzazione utilizzando un robot cristallizzazione. Crescere cristalli di vapo diffusione a 18 ° C tramite la tecnica calo seduto in una piastra a 96 pozzetti con un serbatoio contenente 60 ml di tampone cristallizzazione (acqua madre) 21. Concentrare il Phla solubile a circa 10 mg / ml (0,2 mM) in tampone cristallo facendo girare a 3000 xg in una centrifuga concentratore cut-off di peso molecolare 10 kDa. Per le strutture co-complesso, mescolare il TCR e Phla in un rapporto 1: 1 molare per ottenere una soluzione proteica di circa 10 mg / ml (0,1 mM). Aggiungere 200 nL di Phla sola, o 1: 1 rapporto molare della miscela di TCR e Phla, a 200 nL di ciascuna soluzione serbatoio dalla schermata di cristallizzazione utilizzando un robot cristallizzazione e segnare per cristalli al microscopio dopo 24 h, 48 h, 72 h, e poi una volta a settimana. Harvest cristalli singoli di montarli manualmente in crio-loop sotto un microscopio e crio-raffreddare immergendo e la loro memorizzazione in azoto liquido (100 K). NOTA: Caricamento cristalli prende un po 'di PRACTice, e decidere quali cristalli sono abbastanza buono per la raccolta dei dati viene con l'esperienza. Come regola generale, il più grande e più regolare il cristallo, il migliore. Raccogliere dati in un flusso di gas di azoto a 100 K. NOTA: questi dati è stata acquisita presso il Diamond Light Source (DLS) impianto di scienza di sincrotrone nazionale nel Regno Unito. Analizzare i dati stimando le intensità di riflessione con xia2 utilizzando sia 22 MOSFLM e XDS pacchetti 23, e poi scalare i dati con SCALA o AIMLESS 24 e il pacchetto CCP4 25. Risolvere le strutture con la sostituzione molecolare utilizzando PHASER 26. Regolare il modello con COOT 27 e perfezionare il modello con REFMAC5 28. Preparare rappresentazioni grafiche con PyMOL 29. Calcolare i contatti utilizzando il "contatto"programma nel pacchetto CCP4. Utilizzare un cut-off 4 A per van der Waals e un 3.4 un cut-off per i legami idrogeno e ponti salini. Calcola complementarità superficie utilizzando il programma "SC" nel pacchetto CCP4. Calcolare l'angolo di incrocio del complesso TCR-Phla, come descritto 30. NOTA: Per questo studio, i dati di riflessione e le coordinate finali del modello sono stati depositati presso la banca dati PDB (PMEL17 TCR-A2-YLE-9V PDB: 5EU6, A2-YLE PDB: 5EU3, A2-YLE-3A PDB: 5EU4 e A2 -YLE-5A PDB: 5EU5).

Representative Results

Utilizzando i metodi di cui sopra, abbiamo generato solubile TCR (Tabella 1) e le molecole Phla per condurre una approfondita analisi molecolari di gp100 280-288 riconoscimento da parte delle cellule T CD8 +. Un sistema di espressione di E. coli modificato è stato utilizzato per generare insolubile IBs per ogni catena separata sia del TCR (catene alfa e beta) e pHLAs (catena α e β2m). Questo metodo ha il vantaggio di essere relativamente economico e facile da installare e genera grandi rese di proteine ​​(100-500 mg / L di coltura). Inoltre, le proteine ​​insolubili sono altamente stabili se conservati a -80 ° C. Abbiamo poi utilizzato una tecnica di ripiegamento e di purificazione consolidata per generare funzionali, omogenee, proteine ​​solubili. Questo metodo è utile per generare proteine ​​per biofisiche, strutturali e cellulari esperimenti, nonché reagenti che possono essere utilizzati per la diagnostica o terapeutica. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Qui, abbiamo usato queste proteine per eseguire esperimenti di mutagenesi scansione alanina attraverso la spina dorsale del peptide e valutata TCR affinità di legame con risonanza plasmonica di superficie (SPR) esperimenti (Tabella 2). Questo test ha dimostrato che residui nel peptide erano più importante per il legame TCR. Ad alta risoluzione Analisi di affinità di legame con questa tecnica sono estremamente utile per determinare meccanismi biologici che controllano le interazioni proteina-proteina, nonché per analizzare l'affinità di legame di molecole terapeutiche. Abbiamo poi cristallizzato un solubile TCR specifico per il melanoma (PMEL17 TCR) in complesso con un Phla modificata tumore-derivato (A2-YLE-9V) per studiare il modo di rilegatura a risoluzione atomica (figure 1 e 2 e Tabella 3). Questi esperimenti forniscono la visualizzazione diretta dell'interfaccia legame tra due molecole, creando un origing informazioni chiave su i principi alla base che governano l'interazione. Abbiamo eseguito un ulteriore analisi termodinamica dell'interazione utilizzando sia SPR e ITC, rivelando i contributi energetici che hanno permesso (figure 3) vincolante. Queste analisi sono state ulteriormente supportato da una descrizione ad alta risoluzione dell'impronta di contatto tra le due proteine (Figura 4 e Tabella 4). Abbiamo poi risolto le strutture delle molecole Phla unligated, presentando forme mutate del peptide, rivelando che un interruttore molecolare potrebbe spiegare perché alcune mutazioni abrogati TCR vincolante (figure 5). Nel complesso, queste tecniche forniti nuovi dati che dimostrano il meccanismo che spiega come le cellule T riconoscono un antigene melanoma di derivazione che è un obiettivo importante per terapie anti-cancro. Più in generale, queste tecnichepuò essere utilizzato per indagare su qualsiasi interazione recettore-ligando, scoprire nuovi meccanismi biologici che potrebbero essere oggetto di nuovi progressi terapeutici. Figura 1: densità Analisi Plot. Gli spettacoli colonna sinistra omettono mappe in cui il modello è stato affinato in assenza del peptide. Densità differenza è sagomato a 3.0 sigma, contorni positivi sono mostrati in verde, e contorni negativi sono di colore rosso. La colonna di destra mostra la mappa osservato a 1,0 sigma (mostrato come una maglia grigia intorno rappresentazioni bastone delle catene proteiche) dopo successivo affinamento utilizzare le restrizioni di simmetria non cristallografiche automatiche applicate da REFMAC5. (A) Il modello per PMEL17 TCR-A2-YLE-9V con il TCR CDR3 loop di colore blu (catena α) e arancione (catena β) e il peptide in verde. (B) Il modello per A2-YLE conil peptide di colore verde scuro. (C) Il modello per A2-YLE-3A con il colore arancione peptide (per A2-YLE-3A, c'erano 2 molecole nell'unità asimmetrica, ma questi erano praticamente identiche in termini di mappe Omettere e densità, in modo che solo copiare 1 è mostrato qui). (D) Il modello per A2-YLE-5A con il peptide di colore rosa. Ristampato con il permesso di riferimento 31. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2: Panoramica del PMEL17 TCR in complesso con A2-YLE-9V. Rappresentazione (A) del fumetto del complesso PMEL17 TCR-A2-YLE-9V. Il TCR è di colore nero; loop TCR CDR sono mostrati (rosso, CDR1α, verde scuro, CDR2α, blu, CDR3α, giallo, CDR1β, aqua, CDR2 ^6 ;; arancio, CDR3β); e HLA-A * 0201 è raffigurato in grigio. Il peptide YLE-9V è rappresentata da bastoncini verdi. (B) di superficie e bastone rappresentazioni di residui del PMEL17 TCR CDR loop (codice colore come in A) che contatto con la superficie A2-YLE (A2, grigio, YLE-9V, bastoni verdi). La linea diagonale nera indica l'angolo di incrocio del TCR rispetto all'asse lungo del peptide YLEPGPVTV (46.15 °). (C) Contatto impronta del PMEL17 TCR sulla superficie A2-YLE-9V (A2, grigio); viola e verde (di superficie e bastoncini) indicano l'HLA-A * 0201 e residui YLE, rispettivamente contattati dalla TCR gp100. Cut-off di 3.4 Å per legami di idrogeno e 4 A per van der Waals. Ristampato con il permesso di riferimento 31. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt = "Figura 3" src = "/ files / ftp_upload / 54991 / 54991fig3.jpg" /> Figura 3: Analisi termodinamica del PMEL17 Interaction TCR-A2-YLE. (A) PMEL17 TCR equilibrio vincolante risposte a A2-YLE a 5, 12, 18, 25, e 37 ° C in nove a dieci diluizioni seriali TCR. SPR dati grezzi e muro (assumendo 1: 1 vincolante Langmuir) sono mostrati nel riquadro di ogni curva e sono stati utilizzati per calcolare K e K off valori utilizzando un algoritmo globale-fit (BIAevaluation 3.1). La tabella mostra equilibrio poroso (K D (E)) e costanti cinetiche poroso (K D (K) = K off / K) per ogni temperatura. L'equilibrio di legame costante (K D, micron) i valori sono stati calcolati utilizzando un fit lineare (y = (P1x) / (P2 + x)). (B) i parametri termodinamici sono stati calcolati secondo l'equazione di Gibbs-Helmholtz (DeltaG ° = d H ° – TΔS °). Le energie libere di legame, DeltaG ° (DeltaG ° = -RTlnK D), sono state tracciate contro di temperatura (K) utilizzando una regressione lineare per adattare l'equazione a tre parametri (y = d H ° + ΔCp ° * (x-298) -x * ΔS ° -x * ΔCp ° * ln (x / 298)). Entalpia (d H °) e l'entropia (TΔS °) a 298 K (25 ° C) sono mostrati in kcal / mol e sono stati calcolati da una regressione non lineare della temperatura (K) tracciate contro l'energia libera (DeltaG °). (C) isotermica di titolazione calorimetrica (ITC) misure per l'interazione TCR-A2-YLE PMEL17. Entalpia (d H °) e l'entropia (TΔS °) a 298 K (25 ° C) sono mostrati in kcal / mole. Ristampato con il permesso di riferimento 31. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <str ong> Figura 4: Il PMEL17 CDR Loops Focus on Peptide residui Pro4, Val7, e Thr8. (A) Rappresentazione schematica dei contatti tra il peptide YLE-9V e residui ciclo PMEL17 CDR (codice colore come nella Figura 2A). I numeri in basso del pannello mostrano i contatti totali tra il TCR e il peptide. (B) I contatti tra la PMEL17 TCR e il peptide YLE-9V (bastoncini verdi) che mostra il van der Waals (nero linee tratteggiate) e legami a idrogeno (rosso linee tratteggiate) fatte dal TCR CDR3α (blu), CDR1β (giallo) , CDR2β (acqua), e CDR3β (arancione) loop. Nel pannello inferiore è una vista ravvicinata dei contatti tra YLE Pro4, Val7, e Thr8, rispettivamente, e residui di anello TCR CDR (colore bastoni codificato come in Figura 1A). Cut-off di 3.4 Å per legami di idrogeno e 4 A per van der Waals. Ristampato con il permesso di riferimento 31.rge.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 5: Confronto conformazionale di YLE, YLE-3A, e A2-YLE-5A Peptidi Presentato da HLA-A * 0201. (A) YLE (bastoni verde scuro) e YLE-3A (bastoncini d'arancio) allineamento peptide dalla sovrapposizione di HLA-A * 0201 α1 elica (cartone grigio). residui in scatola indicano la mutazione di Glu3 in un alanina. I riquadri mostrano come la sostituzione Glu3Ala provoca uno spostamento in posizione (freccia nera) di Pro4 prossimo residuo nella struttura A2-YLE-3A rispetto alla struttura A2-YLE. (B) YLE (bastoncini di colore verde scuro) e YLE-5A (bastoni rosa) allineamento peptide dalla sovrapposizione di HLA-A * 0201 α1 elica (cartone grigio). I residui scatola indicano la mutazione di glicina 5 in una alanina. Ristampato con il permesso di riferimento <sup> 31. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. TCR CDR1α CDR2α CDR3α CDR1β CDR1β CDR1β PMEL17 DSAIYN IQSSQRE CAVLSSGGSNYKLTFG SGHTA FQGTGA CASSFIGGTDTQYFG gp100 TSINN IRSNERE CATDGDTPLVFG LNHDA SQIVND CASSIGGPYEQYFG <strong> MPD KALYS LLKGGEQ CGTETNTGNQFYFG SGHDY FNNNVP CASSLGRYNEQFFG 296 DSASNY IRSNVGE CAASTSGGTSYGKLTFG MNHEY SMNVEV CASSLGSSYEQYFG Tabella 1: Allineamento di TCR CDR3 Regioni della PMEL17, gp100, MPD, e 296 TCR specifici GP100. Ristampato con il permesso di riferimento 31. sequenza peptidica peptide PMEL17 TCR TRAV21 TRBV7-3 Affinity K D gp100 TCR TRAV17 TRBV19 Affinità K D YLEPGPVTA YLE 7.6 ± 2 micron 26.5 ± 2.3 micron YLEPGPVT V YLE-9V 6.3 ± 1.2 micron 21.9 ± 2.4 micron A LEPGPVTA YLE-1A 15.9 ± 4.1 micron 60,6 ± 5,4 micron YL A PGPVTA YLE-3A No binding No binding YLE A GPVTA YLE-4A 19,7 ± 1,3 micron 144,1 ± 7,8 micron YLEP A PVTA YLE-5A > 1 mM > 1mM YLEPG A VTA YLE-6A 11.4 ± 2.7 micron 954.9 ± 97.8 micron </tr> YLEPGP A TA YLE-7A 31.1 ± 4 micron 102.0 ± 9.2 micron YLEPGPV A A YLE-8A 38.1 ± 7.4 micron 121.0 ± 7.5 micron Tabella 2: Analisi Affinity (K D) di PMEL17 TCR e TCR gp100 di gp100 280-288 varianti del peptide. Ristampato con il permesso di riferimento 31. parametri PMEL17 TCR-A2-YLE-9V A2-YLE A2-YLE-3A A2-YLE-5A Codice PDB </strong> 5EU6 5EU3 5EU4 5EU5 statistiche dataset gruppo spaziale P1 P1 21 1 P1 P1 21 1 parametri di cella Unità (A) a = 45.52, b = 54.41, c = 112.12, a = 85,0 °, b = 81.6 °, 72.6 ° g = a = 52.81, b = 80.37, c = 56.06, b = 112.8 ° a = 56.08, b = 57.63, c = 79.93, a = 90,0 °, b = 89,8 °, g = 63.8 ° a = 56.33, b = 79.64, c = 57.74, b = 116,2 ° sorgente di radiazione DIAMOND I03 DIAMOND I03 DIAMOND I02 DIAMOND I02 Lunghezza d'onda (Å) 0,9763 0.9999 0,9763 0,9763 measuPortata Risoluzione rossa (A) 51,87-2,02 45,25-1,97 43,39-2,12 43,42-1,54 Outer Risoluzione Shell (Å) 2,07-2,02 2,02-1,97 2,18-2,12 1,58-154 riflessione osservato 128.191 (8.955) 99.442 (7.056) 99.386 (7.463) 244.577 (17.745) riflessi unici 64.983 (4.785) 30.103 (2.249) 49.667 (3.636) 67.308 (4.962) Completezza (%) 97,7 (96,7) 98,5 (99,3) 97.4 (96.7) 99,6 (99,9) moltiplicità 2.0 (1.9) 3.3 (3.1) 2.0 (2.1) 3.6 (3.6) I / Sigma (I) 5.5 (1.9) 7.2 (1.9) 6,7 (2.3) 13 (2.3) Rpim (%) 5.7 (39.8) 8.8 (44.7) 8.7 (41.6) 4,5 (35,4) R merge (%) 7.8 (39.6) 9,8 (50,2) 8.7 (41.6) 5.0 (53.2) statistiche raffinatezza Risoluzione (Å) 2.02 1.97 2.12 1.54 Non ci sono riflessioni utilizzati 61688 28557 47153 63875 No riflessione in Rfree set 3294 1526 2514 3406 R cryst (no cut-off) (%) 18.1 19,7 17.2 17,0 R gratis 22.2 25.5 21.1 20.1 Radice scarto quadratico medio dalla geometria ideale lunghezze di legame (A) 0,018 (0,019) * 0,019 (0,019) * 0,021 (0,019) * 0,018 (0,019) * angoli di legame (°) 1.964 (1.939) * 1.961 (1.926) * 2.067 (1.927) * 1.914 (1.936) * Nel complesso coordinare errore (Å) 0,122 0,153 0.147 .055 Ramachandran Statistiche più favorita 791 (96%) 371 (98%) 749 (99%) 384 (98%) Permesso 32 (4%) 6 (2%) 10 (1%) 5 (1%) Valori anomali 2 (0%) 3 (1%) 1 (0%) 2 (0%) Tabella 3: riduzione dei dati e raffinatezza statistiche (sostituzione molecolare). Ristampato con il permesso di riferimento 31. I valori tra parentesi sono per la shell più alta risoluzione. HLA / residui peptide residui TCR No. vdW (≤4Å) No. H-bond (≤3.4Å) Gly62 αGly98 3 αSer99 1 Arg65 αSer99 2 <td> Arg65 O αAsn100 Nδ2 2 1 Arg65 NH1 βAsp58 Oδ2 1 βSer59 8 Lys66 αGly98 1 αSer99 4 αAsn100 4 Ala69 αAsn100 2 βAla56 2 Gln72 Nε2 βGln51 O 3 1 βGly54 7 βAla55 1 <td> Thr73 βGln51 1 Val76 βGln51 3 βGly52 2 Lys146 βPhe97 3 βIle98 3 Ala150 βIle98 1 βAsp102 3 Val152 βIle98 1 Glu154 αTyr32 1 Gln155 N αTyr32 OH 4 1 Gln155 Oε1 βThr101 N 10 1 <tr> Tyr1 OH αGly97 O 1 1 αGly98 1 αSer96 1 Glu3 αTyr101 1 Pro4 αSer96 1 αSer99 1 αAsn100 4 Pro4 O αTyr101 N 14 1 Gly5 αTyr101 3 βGly100 2 Val7 βIle98 7 βGly99 2 βGly100 2 Thr8 βThr31 5 βGln51 1 βPhe97 1 Thr8 N βIle98 O 6 1 Tabella 4: PMEL17 TCR-A2-YLE-9V contatto Table. Ristampato con il permesso di riferimento 31.

Discussion

I protocolli descritti qui forniscono un quadro per la dissezione molecolare e cellulare di risposte delle cellule T nel contesto di una malattia umana. Anche se il cancro è stato l'obiettivo principale di questo studio, abbiamo utilizzato metodi molto simili a indagare le risposte delle cellule T a virus 32, 33, 34, 35, 36, 37 e durante l'autoimmunità 38, 39, 40. Inoltre, abbiamo usato queste tecniche in modo più ampio per comprendere i principi molecolari che governano cellule T riconoscimento dell'antigene 2, 19, 41, 42. In effetti, la natura imprevedibile di modifiche al peptide residui, anche quellial di fuori della dei residui di contatto TCR, il riconoscimento impatti delle cellule T ha importanti implicazioni per la progettazione di peptidi eterocliti. Questi risultati hanno contribuito direttamente allo sviluppo di nuove terapie cellule T, i vaccini peptidici 6, 43 e TCR alta affinità artificiali 3, 4, 5, 20, 44, nonché della diagnostica potenziate 45, 46, 47.

Passaggi critici all'interno del protocollo
La generazione di una proteina altamente pura, funzionale è essenziale per tutti i metodi descritti nel presente documento.

Modifiche e risoluzione dei problemi
Le difficoltà nel generare proteine ​​altamente puro spesso interessano la espressione altamentepuro al, insolubile IBs dal sistema di espressione di E. coli. Di solito, la modifica del protocollo di espressione (ad esempio, inducendo a differenti densità ottiche, utilizzando diversi ceppi di E. coli, o con diverse formazioni di media) risolve questi problemi.

Limitazioni della tecnica
Queste tecniche utilizzano molecole proteiche solubili (TCR e Phla) che normalmente vengono espressi sulla superficie cellulare. Pertanto, è importante garantire che / risultati biofisici strutturali sono coerenti con approcci cellulari per confermare significato biologico.

Importanza della tecnica rispetto ai metodi esistenti / alternativi
Attraverso l'uso di cristallografia a raggi X e biofisica giustificati attraverso l'analisi funzionale, noi e altri hanno dimostrato che il TCR specifico per epitopi tumorali sono generalmente caratterizzati da bassi affinità di legame 48. Questa bassa affinità TCR può aiutare a spiegare il motivo per cui le cellule T are non naturalmente efficace a chiarire il cancro. Ad alta risoluzione delle strutture atomiche di complessi tra TCR anti-cancro e antigeni tumorali affini stanno iniziando a rivelare le basi molecolari per questa affinità debole. Inoltre, questi studi sono utili per determinare i meccanismi che sono alla base degli interventi terapeutici volti a superare questo problema, semina futuri miglioramenti 16. In questo studio, abbiamo esaminato la prima struttura di un αβTCR presenti naturalmente in complesso con un gp100 HLA-A * 0201-ristretta melanoma epitopo. La struttura, combinata con un esame biofisico approfondito, ha rivelato la modalità generale vincolante dell'interazione. Abbiamo anche scoperto un interruttore molecolare, inaspettato, che si è verificato in una forma mutata del peptide, che ha abrogato TCR vincolante (valutata mediante risonanza plasmonica di superficie) e CD8 + riconoscimento delle cellule T (esperimenti funzionali). E 'stato possibile solo per dimostrare questo nuovo meccanismo di HLA Presentati antigeneon utilizzando i metodi descritti ad alta risoluzione.

Le future applicazioni o direzioni Dopo aver imparato questa tecnica
Nel complesso, i nostri risultati dimostrano il potere della cristallografia a raggi X e metodi biofisici quando combinato con robuste analisi funzionali. Utilizzando questi approcci, è possibile sezionare meccanismi molecolari precise che governano riconoscimento dell'antigene T-cellule. Infatti, è anche possibile utilizzare questo approccio per risolvere la struttura di unligated TCR, dimostrando come cambiamenti conformazionali possono svolgere un ruolo durante antigene discriminazione 49, 50, 51. Una migliore comprensione della natura altamente complesso e dinamico che è alla base delle interazioni TCR-Phla ha anche implicazioni evidenti per la progettazione della terapia. Poter direttamente "vedere" le molecole che vengono terapeuticamente mirati, nonché l'effetto che le modifiche hanno sulle antigene recognition, sarà chiaramente migliorare lo sviluppo di questi farmaci per il futuro. In questo studio, dimostriamo che anche modifiche in un singolo residuo peptide che non è fortemente impegnata da un TCR possono imprevedibilmente trasmettere modifiche strutturali ad altri residui del peptide HLA-bound, che, a sua volta, altera drasticamente riconoscimento T-cellule. Una comprensione più completa dei meccanismi molecolari utilizzati durante il riconoscimento dell'antigene T-cella sarà estremamente utile quando si progetta future terapie per una vasta gamma di malattie umane.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

BM è sostenuto da una borsa di studio di dottorato Cancer Research UK. AG è sostenuto da una borsa di studio Life Science Research Network Wales PhD. VB è sostenuto da una borsa di studio di ricerca sul cancro Galles PhD. DKC è un Wellcome Trust Research Fellow Career Development (WT095767). AKS è un investigatore Wellcome Trust. GHM è finanziato da una joint-Life Science Research Network Galles e Tenovus Cancer Care PhD Studentship. Ringraziamo lo staff di Diamond Light Source per la fornitura di servizi e supporto.

Materials

S.O.C. media Invitrogen
Orbi-Safe New Orbit incubator Sanyo
carbenicillin  Sigma
IPTG  Fisher
Quick Coomassie Stain SafeStain  Generon
Legend RT centrifuge  Sorvall
Tris  Fisher
magnesium chloride  Arcos
NaCl  Fisher
glycerol  Sigma-Aldrich
Sonopuls HD 2070  Bandelin
DNAse  Fisher
Triton Sigma-Aldrich
EDTA  Fisher
guanidine  Fisher
NanoDrop ND1000  Thermo
Peptides Peptide Protein Research
dithiothreitol  Sigma-Aldrich
L-arginine  SAFC
cysteamine  Fisher
cystamine  Fisher
dialysis tubing  Sigma-Aldrich
urea  Sigma-Aldrich
Metricel 0.45 μm membrane filter Pall
POROS 10/100 HQ  Applied biosystems
ÄKTA pure FPLC system  GE Healthcare Life Sciences
10 kDa MWCO Vivaspin 20  Sartorius
10 kDa MWCO Vivaspin 4  Sartorius
Superdex 200 10/300 GL column  GE Healthcare Life Sciences
Phosphate Buffer Saline  Oxoid
BIAcore buffer HBS  GE Healthcare Life Sciences
Biotinylation kit Avidity
BIAcore T200 GE Healthcare Life Sciences
CM5 chip coupling kit GE Healthcare Life Sciences
streptavidin  Sigma-Aldrich
Microcal VP-ITC  GE Healthcare Life Sciences
Hepes  Sigma-Aldrich
Gryphon crystallisation robot Art Robbins Instruments
Intelli-plate  Art Robbins Instruments
Crystallisation screens and reagents Molecular Dimensions
75 cm2 flask  Greiner Bio-One
0.22 μm filters Miller-GP, Millipore
Ultra-Clear ultracentrifuge tube  Beckman Coulter
Optima L-100 XP with SW28 rotor Beckman Coulter
CD8 microbeads  Miltenyi Biotec
anti-CD3/CD28 Dynabeads  Invitrogen
anti-PE microbeads  Miltenyi Biotec
CK medium, PHA Alere Ltd
anti-TCRVβ mAb  BD
dasatinib  Axon
MIP-1β and TNFα ELISA  R&D Systems
 51Cr  PerkinElmer
1450 Microbeta counter PerkinElmer
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MacLachlan, B. J., Greenshields-Watson, A., Mason, G. H., Schauenburg, A. J., Bianchi, V., Rizkallah, P. J., Sewell, A. K., Fuller, A., Cole, D. K. Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens. J. Vis. Exp. (120), e54991, doi:10.3791/54991 (2017).
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