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Immunologie et infection

Mit Röntgenkristallographie, Biophysik, und funktionelle Assays zur Bestimmung der Mechanismen, die T-Zell-Rezeptor-Erkennung von Krebs-Antigene

Published: February 06, 2017
doi:
10.3791/54991
, , , , , , , ,
1Division of Infection and Immunity and Systems Immunity Research Institute,Cardiff University, 2Department of Oncology,University Hospital of Lausanne (CHUV), 3Ludwig Insitutue for Cancer Research, Lausanne Branch,University of Lausanne

Summary

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

Abstract

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Introduction

Röntgenkristallographie wurde und wird auch weiterhin sein, eine extrem leistungsfähige Technik, um die Art von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen zu verstehen. Durch diese Wechselwirkungen in atomarer visualisieren, ist es nicht nur möglich, die molekularen Mechanismen regeln vielen biologischen Prozessen zu verbreiten, aber es ist auch möglich, direkt Kontaktschnittstellen für einen therapeutischen Nutzen zu verändern. In Verbindung mit Techniken wie Oberflächenplasmonresonanz und isothermen Titrationskalorimetrie (um nur ein Paar), können solche Änderungen dann biophysikalisch analysiert werden, um die direkte Auswirkungen auf die Bindungsaffinität zu beurteilen, Interaktion Kinetik und Thermodynamik. Schließlich wird durch funktionelle Experimente an relevanten Zelltypen durchgeführt wird, ein detailliertes Bild von der molekularen und funktionellen Auswirkungen von Modifikationen an Rezeptor-Ligand-Interaktionen können sehr spezifische mechanistische Informationen entnommen, weitergeben. Insgesamt bieten diese Arten von Methoden, um eine atomare Auflösung Bild der Abschreckung ermöglicht Digen, wie biologische Systeme funktionieren, mit den damit verbundenen Auswirkungen auf die diagnostische und therapeutische Fortschritte.

Unser Labor routinemßig verwendet diese Techniken die Rezeptoren zu untersuchen, die menschliche T-Zell-Immunität gegen Krankheitserreger und Krebs, Autoimmunität in und während der Transplantation vermitteln. Hier konzentrieren wir uns auf den menschlichen CD8 + T-Zellantwort auf Krebs, vermittelt durch eine Wechselwirkung zwischen dem T-Zell – Rezeptor (TCR) und Human – Leukozyten – Antigen (HLA) -restringierten tumor-abgeleiteten Peptide (pHLA). Dies ist wichtig , weil, obwohl CD8 + T – Zellen können Krebszellen zu zielen, haben wir und andere zuvor dass TCRs suboptimal ihrer kognaten pHLA 1 binden , anti-Krebs gezeigt, 2. So haben viele Laboratorien versucht zu verändern entweder die TCR 3, 4, 5 oder 6 der Peptidligand,class = "xref"> 7, 8 , um die Immunogenität und zu einer besseren Zielkrebszellen zu erhöhen. Jedoch sind diese Ansätze nicht immer wirksam und können schwere Nebenwirkungen haben, einschließlich off-target Toxizitäten 4, 9, 10. Weitere Untersuchungen der molekularen Mechanismen erforschen, die T-Zell-Erkennung von Krebsantigene regieren wird entscheidend sein, diese Defizite zu überwinden.

In der vorliegenden Studie haben wir uns auf die Antworten gegen autologe Melanomzellen durch CD8 + T – Zellen spezifisch für ein Fragment des Antigens Differenzierung Melanozyten Glykoprotein 100 (gp100), gp100 280-288, präsentiert durch HLA-A * 0201 (die am häufigsten es ausdrücklich menschlichen pHLA Klasse I). Dieses Antigen wurde für Melanome Immuntherapie eine weitgehend untersucht Ziel und hat sich als so genannte "heteroklitischen" Peptid in dem ein Valin Alanin ersetzt entwickeltan Ankerposition 9 11 pHLA Stabilität zu verbessern. Dieser Ansatz wurde verwendet , um die Induktion von Melanom-reaktive CTLs in vitro zu verbessern und 12 in klinischen Versuchen erfolgreich verwendet wurde. Modifikationen an Peptidreste können durch die schlechte Wirksamkeit der meisten heterolitic Peptide in der Klinik unvorhersehbare Wirkungen auf T-Zellspezifität, 6 gezeigt, 13 haben jedoch. Tatsächlich andere heteroklitischen Form von gp100 280-288, in der Peptidrest Glu3 für Ala ersetzt wurde, außer Kraft gesetzt Anerkennung durch einen polyklonalen Population von gp100 280-288 -spezifische T – Zellen 14, 15. Wir haben bereits gezeigt , dass auch geringfügige Änderungen in der Peptidankerreste können T-Zell – Erkennung in unvorhersehbarer Weise 6, im Wesentlichen 16 ändern. So konzentrierte sich die Studie auf Buildein detaillierteres Bild von ing wie CD8 + T – Zellen erkennen gp100 und wie Änderungen der Interaktion zwischen TZR und pHLA könnte diese Funktion auswirken.

Hier erzielten wir hochreine, lösliche Formen von zwei TZR spezifisch für gp100 280-288 präsentiert von HLA-A * 0201 (A2-YLE), sowie die natürlichen und veränderten Formen von pHLA. Diese Reagenzien wurden verwendet, Proteinkristalle zu erzeugen, um die ternäre Atomstruktur eines humanen TCR in Komplex mit dem heteroklitischen Form von A2-YLE sowie zwei der mutanten pHLAs in unligierten Form zu lösen. Wir haben dann ein Ansatz Peptid-Scanning durch die Durchführung in eingehenden biophysikalischen Experimenten die Wirkung von Peptid-Substitutionen auf TZR zu demonstrieren. Schließlich haben wir einen genetisch veränderten CD8 + T-Zelllinie erzeugt, neu programmiert eine der A2-YLE-spezifischen TZR zum Ausdruck bringen, um funktionelle Experimente auszuführen, um die biologischen Auswirkungen der verschiedenen Peptidmodifikationen zu testen. Diese Daten zeigen, daß selbst modikationen Reste an Peptid, die außerhalb des TCR-Bindungsmotiv sind, können auf benachbarten Peptidreste unberechenbar Folgewirkungen haben, die TCR-Bindung und T-Zell-Erkennung außer Kraft setzen. Unsere Ergebnisse stellen das erste Beispiel der strukturellen Mechanismen, T-Zell-Erkennung dieses wichtigen therapeutischen Ziel für Melanome zugrunde liegen.

Protocol

1. Protein Expression Machen Genkonstrukte für die Erzeugung von löslichen TCRs und pHLAs, wie zuvor 17 im Detail beschrieben, 18. Entwerfen jedes Konstrukt mit einer 5'-BamH1 und einem 3'-EcoR1-Restriktionsstelle zur Insertion in den Vektor pGMT7. Transformation E. coli Rosetta (DE3) pLysS mit einem pGMT7 stamm Plasmidvektor die Sequenz , codierend das Protein von Interesse durch Inkubieren von 1 & mgr; l von 50-200 ng / & mgr; l Plasmid mit 5 & mgr; l von E. coli für 5 min bei 4 ° C enthält , , 2 min bei 42 ° C und 5 min bei 4 ° C, und die Platte über Nacht bei 37 ° C auf einer LB-Agarplatte, supplementiert mit 50 mg / L Carbenicillin geführt. Pick einzelne Kolonien und wachsen bei 37 ° C und 220 rpm in 30 ml TYP Medium (16 g / l Trypton, 16 g / l Hefeextrakt und 5 g / L HK 2 O 4) , supplementiert mit 100 uM Carbenicillin , bis die Suspension erreicht eine optische density (OD 600) zwischen 0,4 und 0,6. Induzieren die Proteinproduktion in einem 5 ml Aliquot durch Einführung von 0,5 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) für 3 h. Halten 20 & mgr; l Suspension mit und ohne Induktion für Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) -Analyse und färben das Gel. Hinzufügen Starterkulturen zu 1 l TYP supplementiert mit 100 uM Carbenicillin und wachsen Zellen , wie oben in Schritt 1.3 beschrieben , bis die Suspension eine OD 600 zwischen 0,4 und 0,6 erreicht. Induce Proteinexpression für 3 Stunden mit 0,5 mM IPTG. Zentrifugieren Sie die Zellen für 20 Minuten bei 3000 × g und gießen Sie den Überstand vorsichtig ab. Auflösen des Pellets in 40 ml Lysepuffer (10 mM Tris, pH 8,1; 10 mM Magnesiumchlorid, MgCl 2; 150 mM NaCl; 10% Glycerin), beschallen auf Eis für 30 min bei 60% Leistung ein 2 – s – Intervall unter Verwendung von und für 30 min mit 0,1 g / l DNase bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Behandeln Sie die suspension die Proteine ​​in Form von inclusion bodies (IB) mit 100 ml Waschpuffer, enthaltend (0,5% Triton X-100, 50 mM Tris, pH 8,1; 100 mM NaCl und 10 mM EDTA). Zentrifugieren Sie die Probe für 20 Minuten bei 4 ° C und 8000 xg und gießen Sie den Überstand vorsichtig ab. Resuspendieren des Pellets in 100 ml Resuspension Puffer (50 mM Tris, pH 8,1; 100 mM NaCl und 10 mM EDTA, pH 8,1), zentrifugieren wie bisher bei 8000 xg, und der Überstand vorsichtig abgießen. Schließlich lösen sich die Pellets in 10 ml Guanidin-Puffer (6 M Guanidin, 50 mM Tris, pH 8,1; 2 mM EDTA, pH 8,1, und 100 mM NaCl) und die Proteinkonzentration bei 280 nm gemessen werden unter Verwendung eines Spektrophotometers. 2. pHLA und TCR Neufaltung Für die pHLA faltet, 30 mg von HLA-A2 mischen (oder HLA-A2 mit einem Biotin-Tag) IBs wurden 30 mg & bgr; 2m IBs und 4 mg Peptid für 30 min bei 37 ° C in einem Wasserbad in einem Endvolumen von 6 ml Guanidin-Puffer mit 10 mM Dithiothreitol(DTT). Initiieren Proteinrückfaltungs durch die vorherige Mischung in 1 l einer vorgekühlten HLA Rückfaltungspuffer verdünnt (50 mM Tris, pH 8,1; 400 mM L-Arginin, 2 mM EDTA, pH 8,1; 6 mM Cysteamin und 4 mM Cystamin). Lassen Sie das HLA refold bei 4 ° C für 3 h gerührt und dann gibt sie in eine 12,4 kDa MWCO (Molekulargewicht cut-off) Dialyseschlauch und dialysiere zweimal für 24 h gegen 20 l 10 mM Tris, pH-Wert 8,1. Für die TCR faltet, für 30 min bei 37 ° C in einem Wasserbad in 6 ml Guanidin-Puffer, ergänzt mit 10 mM DTT 30 mg der TCR α-Kette IBs und 30 mg der TCR β-Kette IBs mischen. Initiieren Proteinrückfaltungs durch das denaturierte TCR Mischung in 1 l einer vorgekühlten TCR Rückfaltungspuffer verdünnt (50 mM Tris, pH 8,1, 2,5 M Harnstoff, 2 mM EDTA, pH 8,1; 6 mM Cysteamin und 4 mM Cystamin) für 3 h. Übertragung der Rückfaltungs in eine 12,4-kDa MWCO Dialyseschlauch und dialysieren zweimal für 24 h gegen 20 l 10 mM Tris, pH 8,1. Filter sowohl die pHLA oder TCR refJährigen ein 0,45-um-Membranfilter für die Reinigungsschritte verwendet wird. 3. Reinigung durch Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) Laden des gefilterten Rückfaltungs Zubereitung (entweder pHLA oder TCR) auf eine 7,9 ml, 50 & mgr; m Anionenaustauscherharzsäule voräquilibriert mit 20 ml 10 mM Tris, pH 8,1 auf einer flexiblen und intuitive Chromatographiesystem. Eluieren des Proteins mit 5 ml / min mit einem Salzgradienten (0-500 mM NaCl in 10 mM Tris, pH 8,1, über 8 Säulenvolumina) und sammle 1-ml-Fraktionen. Analysieren Sie die Fraktionen an das Protein von Interesse durch SDS-PAGE entspricht, bündeln die Fraktionen, die das Protein von Interesse enthält, zusammen und konzentrieren sie mit 10-kDa MWCO bis 500 & mgr; l um 20 oder 10 kDa MWCO 4 durch Zentrifugation für 20 min bei 4000 · g die durch~~POS=TRUNC verwerfen. Legen Sie die konzentrierte Proteinpräparate in eine 2 ml Injektionsschleife auf eine 24 ml Grßenausschlußchromatographie Säule mit dem App-Pre ins Gleichgewicht gebrachtropriate Elutionspuffer: phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), HBS (10 mM HEPES, pH 7,4; 150 mM NaCl; 3,4 mM EDTA und 0,005% Tensid) oder Kristall-Puffer (10 mM Tris, pH 8,1, und 10 mM NaCl ). Eluieren der Proteine ​​mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml / min über 1 Säulenvolumen; sammeln 1 ml Fraktionen, die das Protein von Interesse nachgewiesen durch SDS-PAGE enthält. HINWEIS: Diese Methoden verwendet löslichen Pmel17 TCR und gp100 TZR zu erzeugen, sowie alle der pHLAs in dieser Studie verwendet: HLA-A * 0201 mit YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- 7A) oder YLEPGPVAA (A2-YLE-8A). 4. Oberflächenplasmonresonanz (SPR) Analyse Führen Gleichgewichts-Bindungsanalyse oder thermodynamischen Analyse eine molekulare Wechselwirkung Analysesystem , ausgestattet mit einem CM5 – Sensorchip 19 verwendet wird . Aktivieren Sie den CM5-Chip von fgende ein 1: 1-Mischung aus 100 mM N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 400 mM 1-Ethyl-3- (3-dimethylpropyl) -carboiimide (EDC) für 10 min bei einer Flussrate von 10 & mgr; l / min und bei 25 & deg; C. Last ca. 5.000 Antworteinheiten (RU) von Streptavidin (110 & mgr; l von 200 & mgr; g / ml in 10 mM Acetat, pH 4,5) durch kovalente Verknüpfung mit der Chipoberfläche in allen vier Strömungszellen und Verwendung von 100 & mgr; l 1 M Ethanolaminhydrochlorid zu desaktivieren alle verbleibenden reaktiven Gruppen. Paar etwa 500-600 RU von pHLA, bei ~ 1 & mgr; M in kommerziellen Puffer (vom Hersteller geliefert), an den CM5-Sensorchip mit einer langsamen Flussgeschwindigkeit von 10 & mgr; l / min eine gleichmäßige Verteilung auf der Chipoberfläche zu gewährleisten. Tränken Sie den Chipoberfläche mit 1 mM Biotin in kommerziellen Puffer (vom Hersteller zur Verfügung gestellt) für 60 s. Injizieren zehn serielle Verdünnungen der löslichen TCRs über den entsprechenden Strömungszellen mit einer hohen Strömungsrate von 30 & mgr; l / min bei 25 ° C. Berechnen Sie die Gleichgewichtsbindungskonstante(K D (E)) -Werten unter Verwendung eines nichtlinearen Kurvenanpassung (y = (P1x) / (P2 + x)) 20. HINWEIS: y = Antworteinheiten, x = Analyst Konzentration, P1 = r max, P2 = K D. Führen Kinetik – Analyse eine 1 unter der Annahme: 1 Langmuir Bindung und passen Sie die Daten mit Hilfe eines global-Fit – Algorithmus in der Software – Paket 2. Führen Thermodynamik Experimente durch diese Methode bei folgenden Temperaturen zu wiederholen: 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C und 30 ° C 19. Verwenden Sie die K D von SPR ermittelten Werte bei verschiedenen Temperaturen & Delta; G ° unter Verwendung der Standard – thermodynamischen Gleichung (& Delta; G ° = -RTlnK D) 19 zu berechnen. HINWEIS: R = Gaskonstante, T = Temperatur in K, ln = natürlicher Logarithmus. Berechnen Sie die thermodynamischen Parameter entsprechend der Gibbs-Helmholtz – Gleichung (& Delta; G ° = AH – TΔS °) 19. </li> Zeichnen Sie die freien Bindungsenergien, & Delta; G ° (& Delta; G ° = -RTlnK D), gegen die Temperatur (K) eine nicht – lineare Regression unter Verwendung der Drei-Parameter – Gleichung passen (y = & Delta; H + ACp * (x-298) -x * ΔS- x * & Delta; Cp * ln (x / 298)) 19. HINWEIS: y = Temperatur in K, x = & Dgr; G °. 5. Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) Führen ITC Experimenten eine isotherme Titrationskalorimeter verwenden. Injizieren 30 uM pHLA in das Kalorimeter Zelle und Last 210 uM löslichen TCR in die Spritze. Verwenden Sie die folgenden Pufferbedingungen: 20 mM Hepes (pH 7,4), der 150 mM NaCl. Führen TCR 20 Injektionen, die jeweils aus einem 2 & mgr; l Volumen. Berechnen & Delta; H und K D analytische Software. 6. Die Kristallisation, Diffraction Data Collection und Modellpflege Führen Sie Kristallisationsversuche einen Kristallisations Roboter. Wachsen Kristalle von VAPoder Diffusion bei 18 ° C über der Sitz Drop – Technik in einer 96-Well – Platte mit einem Reservoir , enthaltend 60 & mgr; l Kristallisationspuffer (Mutterlauge) 21. Konzentriere das lösliche pHLA bis etwa 10 mg / ml (0,2 mM) in Kristall Puffer in einem 10-kDa-Molekulargewicht-Cut-off Zentrifugalkonzentrator bei 3.000 xg dreht. Für die Co-komplexe Strukturen, bei einem 1 den TCR und pHLA mischen: 1-Molverhältnis eine Proteinlösung zu erhalten, bei etwa 10 mg / ml (0,1 mM). Mit 200 nL von pHLA allein oder das 1: 1-Molverhältnis Mischung von TCR und pHLA, bis 200 nL jeder Vorratslösung aus der Kristallisations Bildschirm einen Kristallisations Roboter und für Kristalle unter einem Mikroskop nach 24 h, 48 h erzielen, 72 h und dann einmal pro Woche. Ernte-Einkristalle durch manuell in Kryo-Schleifen unter einem Mikroskop Montage und Kryo-kühlen sie durch Untertauchen und sie in flüssigem Stickstoff zu speichern (100 K). HINWEIS: Das Laden Kristalle nimmt ein wenig pracTice, und für die Datensammlung gut genug, die Kristalle der Entscheidung kommt mit der Erfahrung. Als Faustregel gilt: Je größer und regelmäßig den Kristall, desto besser. Sammeln von Daten in einem Strom von Stickstoffgas bei 100 K. HINWEIS: Diese Daten können bei der Diamond Light Source (DLS) nationalen Synchrotron Wissenschaft Einrichtung in Großbritannien erworben. Analysieren Sie die Daten , die durch die Reflexionsintensitäten mit xia2 Schätzen sowohl mit MOSFLM 22 und XDS – Pakete 23, und dann skaliert die Daten mit SCALA oder ZIELLOSES 24 und dem CCP4 Paket 25. Lösen Sie die Strukturen mit molekularen Ersatz mit PHASER 26. Stellen Sie das Modell mit BLÄSSHUHN 27 und verfeinern das Modell mit REFMAC5 28. Bereiten Sie grafische Darstellungen mit PyMOL 29. Berechnen Sie die Kontakte mit dem "Kontakt"Programm in dem CCP4-Paket. Verwenden Sie ein 4 Å Cut-off für van der Waals-Kontakte und eine 3.4 Å Cut-off für Wasserstoffbrückenbindungen und Salzbrücken. Berechnen Oberflächenkomplementarität die "SC" Programm in der CCP4-Paket. Berechnen der Kreuzungswinkel des TCR-Komplexes pHLA, wie 30 beschrieben. HINWEIS: Für diese Studie wurden die Reflexionsdaten und endgültige Modell Koordinaten mit der PDB-Datenbank hinterlegt (Pmel17 TCR-A2-YLE-9V PDB: 5EU6, A2-YLE PDB: 5EU3, A2-YLE-3A HVE: 5EU4 und A2 -YLE-5A HVE: 5EU5).

Representative Results

Molekulare Analysen von gp100 280-288 Erkennung durch CD8 + T – Zellen unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren erzeugten wir löslichen TCR (Tabelle 1) und pHLA Moleküle in die Tiefe zu führen. Eine modifizierte E. coli – Expressionssystem wurde verwendet , unlöslich IBs zu erzeugen , sowohl für jede einzelne Kette des TZR (α und β – Ketten) und pHLAs (α – Kette und ß2m). Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass sie relativ billig und einfach einzurichten und große Proteinausbeuten erzeugt (100-500 mg / l Kultur). Auch sind die unlöslichen Proteine ​​sehr stabil, wenn bei -80 ° C gelagert. Wir haben dann ein gut etabliertes Neufaltung und Reinigungstechnik funktionell, homogene, lösliche Proteine ​​zu erzeugen. Dieses Verfahren ist nützlich für die Proteine, die für biophysikalische, strukturellen und zellulären Experimenten sowie Reagenzien erzeugen, die für die Diagnose oder Therapie verwendet werden können. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Hier verwendeten wir diese Proteine Alanin – Scan – Mutagenese – Experimente über die Peptidrückgrats und ausgewertet TCR – Bindungsaffinität unter Verwendung von Oberflächenplasmonresonanz (SPR) Versuche (Tabelle 2) durchzuführen. Dieser Test zeigte, die in der Peptidreste am wichtigsten waren für die TCR-Bindung. Hochauflösende Analyse der Bindungsaffinitäten dieser Technik sind extrem nützlich für die biologischen Mechanismen zu bestimmen, die Protein-Protein-Wechselwirkungen zu steuern, als auch für die Bindungsaffinität von therapeutischen Molekülen analysiert wird. Wir kristallisiert dann ein Melanom-spezifischen löslichen TCR (TCR Pmel17) im Komplex mit einem modifizierten tumorderivierten pHLA (A2-YLE-9V) den Bindungsmodus mit atomarer Auflösung (Figuren 1 und 2 und Tabelle 3) , zu untersuchen. Diese Experimente liefern eine direkte Visualisierung der Bindung Schnittstelle zwischen zwei Molekülen, providing die wichtigsten Informationen über die zugrunde liegenden Prinzipien der Interaktion regeln. Wir führten weiterhin eine thermodynamischen Analyse der Interaktion mit beiden SPR und ITC, die energetischen Beiträge enthüllt , die Bindung aktiviert (Abb 3). Diese Analysen wurden weiter unterstützt durch eine hochauflösende Darstellung des Kontakt Fußabdrucks zwischen den beiden Proteinen (Figur 4 und Tabelle 4). Wir lösten dann die Strukturen der unligierte pHLA Moleküle, mutierte Formen des Peptids präsentiert und enthüllt , dass ein molekularer Schalter erklären könnte , warum bestimmte Mutationen außer Kraft gesetzt TCR – Bindung (Abbildungen 5). Insgesamt sofern diese Techniken neue Daten den Mechanismus zeigt, zu erklären, wie T-Zellen ein Melanom stammenden Antigen erkennen, dass ein wichtiges Ziel für Anti-Krebs-Therapeutika ist. Allgemeiner gesagt, diese Technikenkann praktisch jeder Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung zu untersuchen, verwendet werden, neue biologische Mechanismen aufzudecken, die für neuartige therapeutische Fortschritte ausgerichtet werden könnten. Abbildung 1: Dichte – Plot – Analyse. Die linke Spalte zeigt auslassen Karten in dem das Modell in Abwesenheit des Peptids verfeinert wurde. Difference Dichte bei 3,0 Sigma konturiert werden positive Konturen in grün dargestellt, und negative Konturen sind rot. Die rechte Spalte zeigt die beobachteten Karte bei 1,0 Sigma (als grauer Masche um Stick Darstellungen der Proteinketten dargestellt) nach anschließender Verfeinerung unter Verwendung einer automatischen nichtkristallographische Symmetrie Beschränkungen, die von REFMAC5 angewendet. (A) Das Modell für Pmel17 TCR-A2-YLE-9V mit dem TCR CDR3 – Schleifen blau gefärbt (α – Kette) und orange (β – Kette) und das Peptid in grün. (B) Das Modell für A2-YLE mitdas Peptid dunkelgrün gefärbt. (C) Das Modell für A2-YLE-3A mit dem orangefarbenen Peptid gefärbt (für A2-YLE-3A gab es zwei Moleküle in der asymmetrischen Einheit, aber diese waren praktisch identisch in Bezug auf wegzulassen und Dichtekarten, so kopieren Sie nur 1 ist hier gezeigt). (D) Das Modell für A2-YLE-5A mit dem Peptid rosa gefärbt. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung aus Lit. 31. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2: Überblick über die Pmel17 TCR im Komplex mit A2-YLE-9V. (A) Cartoon Darstellung des Pmel17 TCR-A2-YLE-9V – Komplex. Der TCR ist schwarz gefärbt; TCR CDR-Schleifen dargestellt (rot, CDR1α, dunkelgrün, CDR2α, blau, CDR3α, gelb, CDR1β, aqua, CDR2 ^6 ;; orange, CDR3β); und das HLA-A * 0201 ist in grau dargestellt. Die YLE-9V Peptid wird durch grün-Sticks vertreten. (B) Oberfläche und kleben Darstellungen von Resten der Pmel17 TCR CDR – Schleifen (farbcodiert , wie in A), der A2-YLE Oberfläche berühren (A2, grau; YLE-9V, grün – Sticks). Die schwarze diagonale Linie zeigt den Kreuzungswinkel des TCR in Bezug auf die Längsachse des YLEPGPVTV Peptid (46,15 °). (C) Kontakt Fußabdruck des Pmel17 TCR auf der A2-YLE-9V Oberfläche (A2, grau); violett und grün (Oberfläche und Stöcke) zeigen die HLA-A * 0201 und YLE Reste, die jeweils von der gp100 TCR in Kontakt gebracht. Cut-off von 3,4 Å für Wasserstoffbrückenbindungen und 4 Å für van der Waals-Kontakte. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz 31. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt = "3" src = "/ files / ftp_upload / 54991 / 54991fig3.jpg" /> Abbildung 3: Thermodynamische Analyse des Pmel17 TCR-A2-YLE – Wechselwirkung. (A) Pmel17 TCR Gleichgewichts-Bindungsreaktionen zu A2-YLE bei 5, 12, 18, 25 und 37 ° C über neun bis zehn TCR Reihenverdünnungen. SPR Roh- und angepassten Daten (unter der Annahme 1: 1 Langmuir – Bindung) sind in der Einfügung jeder Kurve gezeigt und wurden verwendet , um K zu berechnen auf und K off – Werte unter Verwendung eines global-Fit – Algorithmus (BIAevaluation 3.1). Die Tabelle zeigt die Gleichgewichtsbindenden (K D (E)) und kinetische Bindungskonstanten (K D (K) = K off / K on) bei jeder Temperatur. Unter Verwendung eines nicht – linearen Anpassung (y = (P1x) / (P2 + x)) Die Gleichgewichtsbindungskonstante (K D, uM) wurden Werte berechnet. (B) Die thermodynamischen Parameter wurden berechnet nach der Gibbs-Helmholtz – Gleichung (& Dgr; G & deg ; = & Dgr; H ° – TΔS °). Die Bindungsenergien, & Delta; G ° (& Dgr; G & deg ; = -RTlnK D) wurden aufgetragen gegen die Temperatur (K) eine nicht – lineare Regression unter Verwendung der Drei-Parameter – Gleichung angepasst (y = & Dgr; H ° + & Delta; Cp * ° (x-298) -x * & Dgr; S ° -x * & Delta; Cp ° * ln (x / 298)). Enthalpie (& Dgr; H & deg;) und der Entropie (TΔS °) bei 298 K (25 ° C) sind in kcal / mol gezeigt und wurden durch eine nicht-lineare Regression der Temperatur (K) aufgetragen gegen die freie Energie (& Dgr; G °) berechnet. (C) Isotherme kalorimetrische Titration (ITC) Messungen für die Pmel17 TCR-A2-YLE Interaktion. Enthalpie (& Dgr; H & deg;) und der Entropie (TΔS °) bei 298 K (25 ° C) sind in kcal / mol dargestellt. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung aus Lit. 31. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <str ong> Abbildung 4: Die Pmel17 CDR-Schleifen Fokus auf Peptidreste Pro4, Val7 und Thr 8. (A) Schematische Darstellung der Kontakte zwischen dem YLE-9V – Peptid und dem Pmel17 CDR – Schleifenreste (farbcodiert , wie in 2A). Die Zahlen am unteren Rand des Paneels zeigen die Gesamt Kontakte zwischen dem TCR und dem Peptid. (B) Kontakte zwischen dem Pmel17 TCR und der YLE-9V – Peptid (grün – Sticks), die die van der Waals – Kontakte (schwarz gestrichelte Linien) und Wasserstoffbrückenbindungen (rot gestrichelte Linien), der durch den TCR CDR3α (blau), CDR1β (gelb) , CDR2β (aqua) und CDR3β (orange) in einer Schleife. In der unteren Platte ist eine enge Sicht auf die Kontakte zwischen YLE Pro4, Val7 und Thr 8 bzw. und TCR CDR-Schleifenreste (Farbe Sticks codiert, wie in Abbildung 1A). Cut-off von 3,4 Å für Wasserstoffbrückenbindungen und 4 Å für van der Waals-Kontakte. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung aus Lit. 31.rge.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 5: Konformationsänderungen Vergleich von YLE, YLE-3A und A2-YLE-5A Peptide Präsentiert von HLA-A * 0201. (A) YLE (dunkelgrün – Sticks) und YLE-3A (orange – Sticks) Peptid Ausrichtung durch die Überlagerung von HLA-A * 0201 α1 Helix (grau Cartoon). Boxed Reste zeigen die Mutation von Glu3 in einem Alanin. Die Einschübe zeigen, wie die Glu3Ala Substitution eine Verschiebung in der Position bewirkt, dass (schwarzer Pfeil) von Nachbar Rest Pro4 in der A2-YLE-3A-Struktur im Vergleich zu der A2-YLE Struktur. (B) YLE (dunkelgrün – Sticks) und YLE-5A (rosa – Sticks) Peptid Ausrichtung durch die Überlagerung von HLA-A * 0201 α1 Helix (grau Cartoon). Die eingerahmten Reste zeigen die Mutation von Glycin 5 in einem Alanin. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung aus Lit. <sup> 31. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. TCR CDR1α CDR2α CDR3α CDR1β CDR1β CDR1β Pmel17 DSAIYN IQSSQRE CAVLSSGGSNYKLTFG SGHTA FQGTGA CASSFIGGTDTQYFG gp100 TSINN IRSNERE CATDGDTPLVFG LNHDA SQIVND CASSIGGPYEQYFG <strong> MPD KALYS LLKGGEQ CGTETNTGNQFYFG SGHDY FNNNVP CASSLGRYNEQFFG 296 DSASNY IRSNVGE CAASTSGGTSYGKLTFG MNHEY SMNVEV CASSLGSSYEQYFG Tabelle 1: Ausrichtung der TCR CDR3 Regionen Pmel17, gp100, MPD und 296 gp100-spezifischen TZR. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung aus Lit. 31. Peptidsequenz Peptid Pmel17 TCR TRAV21 TRBV7-3 Affinity K D gp100 TCR TRAV17 TRBV19 Affischaft K D YLEPGPVTA YLE 7,6 ± 2 uM 26,5 ± 2,3 uM YLEPGPVT V YLE-9V 6,3 ± 1,2 & mgr; M 21,9 ± 2,4 uM Ein LEPGPVTA YLE-1A 15,9 ± 4,1 uM 60,6 ± 5,4 & mgr; M YL A PGPVTA YLE-3A Keine Bindung Keine Bindung YLE A GPVTA YLE-4A 19,7 ± 1,3 & mgr; M 144,1 ± 7,8 uM YLEP A PVTA YLE-5A > 1 mM > 1 mm YLEPG A VTA YLE-6A 11,4 ± 2,7 & mgr; M 954,9 ± 97,8 & mgr; M </tr> YLEPGP A TA YLE-7A 31,1 ± 4 uM 102,0 ± 9,2 uM YLEPGPV A A YLE-8A 38,1 ± 7,4 & mgr; M 121,0 ± 7,5 uM Tabelle 2: Affinity Analyse (K D) von Pmel17 TCR und gp100 TCR 280-288 Peptidvarianten zu gp100. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung aus Lit. 31. Parameter Pmel17 TCR-A2-YLE-9V A2-YLE A2-YLE-3A A2-YLE-5A PDB – Code </strong> 5EU6 5EU3 5EU4 5EU5 Dataset Statistiken Raumgruppe P1 P1 21 1 P1 P1 21 1 Einheitszellparameter (Å) a = 45,52, b = 54,41, c = 112,12, a = 85,0 °, b = 81,6 °, g = 72,6 ° a = 52,81, b = 80,37, c = 56,06, b = 112,8 ° a = 56,08, b = 57,63, c = 79,93, a = 90,0 °, b = 89,8 °, g = 63,8 ° a = 56,33, b = 79,64, c = 57,74, b = 116,2 ° Die Strahlungsquelle DIAMOND I03 DIAMOND I03 DIAMOND I02 DIAMOND I02 Wellenlänge (Å) 0,9763 0,9999 0,9763 0,9763 measurot Auflösungsbereich (Å) 51,87-2,02 45,25-1,97 43,39-2,12 43,42-1,54 Äußere Resolution Shell (Å) 2,07-2,02 2,02-1,97 2,18-2,12 1,58-154 Reflexion beobachtet 128.191 (8955) 99.442 (7056) 99.386 (7463) 244.577 (17.745) Einzigartige Reflexionen 64.983 (4785) 30.103 (2249) 49.667 (3636) 67.308 (4962) Vollständigkeits (%) 97,7 (96,7) 98,5 (99,3) 97,4 (96,7) 99,6 (99,9) Vielzahl 2,0 (1,9) 3,3 (3,1) 2.0 (2.1) 3.6 (3.6) I / Sigma (I) 5,5 (1,9) 7,2 (1,9) 6,7 (2.3) 13 (2.3) Rpim (%) 5.7 (39.8) 8,8 (44,7) 8,7 (41,6) 4,5 (35,4) R merge (%) 7,8 (39,6) 9.8 (50.2) 8,7 (41,6) 5,0 (53,2) Refinement Statistiken Auflösung (a) 2.02 1,97 2.12 1,54 Keine Reflexionen verwendet 61688 28557 47153 63875 Keine Reflexion in Rfree Set 3294 1526 2514 3406 R Kri (kein Cut-off) (%) 18.1 19.7 17.2 17.0 R frei 22.2 25.5 210,1 20.1 Mittlere quadratische Abweichung von der idealen Geometrie Bindungslängen (Å) 0,018 (0,019) * 0,019 (0,019) * 0,021 (0,019) * 0,018 (0,019) * Bindungswinkel (°) 1.964 (1.939) * 1,961 (1,926) * 2,067 (1,927) * 1,914 (1,936) * Insgesamt Koordinatenfehler (Å) 0,122 0,153 0,147 0,055 Ramachandran Statistiken Meistbegünstigungs 791 (96%) 371 (98%) 749 (99%) 384 (98%) Dürfen 32 (4%) 6 (2%) 10 (1%) 5 (1%) Ausreißer 2 (0%) 3 (1%) 1 (0%) 2 (0%) Tabelle 3: Datenreduktion und Refinement Statistik (molekularen Ersatz). Nachdruck mit freundlicher Genehmigung aus Lit. 31. Die Werte in Klammern sind für die höchste Auflösung Shell. HLA / Peptid – Rest TCR – Rest Nein . VdW (≤4Å) Nein . H-Brücken (≤3.4Å) Gly62 αGly98 3 αSer99 1 Arg65 αSer99 2 <td> Arg65 O αAsn100 Nδ2 2 1 Arg65 NH1 βAsp58 Oδ2 1 βSer59 8 Lys66 αGly98 1 αSer99 4 αAsn100 4 Ala69 αAsn100 2 βAla56 2 Gln72 Nε2 βGln51 O 3 1 βGly54 7 βAla55 1 <td> Thr73 βGln51 1 Val76 βGln51 3 βGly52 2 Lys146 βPhe97 3 βIle98 3 Ala150 βIle98 1 βAsp102 3 Val152 βIle98 1 Glu154 αTyr32 1 Gln155 N αTyr32 OH 4 1 Gln155 Oε1 βThr101 N 10 1 <tr> Tyr 1 OH αGly97 O 1 1 αGly98 1 αSer96 1 Glu3 αTyr101 1 Pro4 αSer96 1 αSer99 1 αAsn100 4 Pro4 O αTyr101 N 14 1 Gly5 αTyr101 3 βGly100 2 Val7 βIle98 7 βGly99 2 βGly100 2 Thr 8 βThr31 5 βGln51 1 βPhe97 1 Thr 8 N βIle98 O 6 1 Tabelle 4: Pmel17 TCR-A2-YLE-9V Kontakttabelle. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung aus Lit. 31.

Discussion

Die Protokolle hier skizzierte einen Rahmen für die molekulare und zelluläre Dissektion von T-Zellantworten in Zusammenhang mit jeder menschlichen Krankheit. Obwohl Krebs der Schwerpunkt dieser Studie war es , wir haben sehr ähnliche Ansätze verwendet , um T-Zell – Antworten auf Viren 32, 33, 34, 35, 36, 37 und während der Autoimmunität 38, 39, 40 zu untersuchen. Weiterhin haben wir diese Techniken im weiteren Sinne zu verstehen , die molekularen Grundlagen verwendet , die T-Zell – Antigenerkennungs 2 regeln, 19, 41, 42. Tatsächlich auf die Unvorhersehbarkeit der Modifikationen Reste-Peptid, auch diejenigen,außerhalb der der TCR Kontaktreste, hat Auswirkungen auf T-Zellerkennung wichtige Implikationen für den Entwurf von heteroklitischen Peptiden. Diese Erkenntnisse haben direkt mit der Entwicklung von neuen T-Zelltherapien beigetragen, einschließlich Peptidvakzinen 6, 43 und künstliche hochaffinen TCRs 3, 4, 5, 20, 44, sowie der verbesserten Diagnostik 45, 46, 47.

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Die Erzeugung eines hochreinen, funktionelles Protein ist für alle der in diesem Dokument beschriebenen Methoden.

Technische Änderungen und Fehlersuche
Schwierigkeiten beziehen sich hochreines Protein erzeugen häufig zur Expression von hochiges, unlösliche IBs aus dem E. coli – Expressionssystem. Üblicherweise Modifizieren der Expression Protokoll (beispielsweise bei unterschiedlichen optischen Dichten Induzieren verschiedene E. coli – Stämme verwendet, oder unter Verwendung verschiedener Medien Formationen) löst diese Probleme.

Einschränkungen der Technik
Diese Techniken verwenden lösliche Proteinmoleküle (TCR und pHLA), die normalerweise an der Zelloberfläche exprimiert. Daher ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Struktur / biophysikalischen Erkenntnisse im Einklang mit zellulären Ansätzen biologische Bedeutung zu bestätigen.

Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / alternative Methoden
Durch die Verwendung von Röntgenkristallographie und durch funktionelle Analyse begründeten Biophysik, haben wir und andere gezeigt , dass TZR spezifisch für Krebs – Epitope 48 durch niedrige Bindungsaffinitäten im Allgemeinen gekennzeichnet. Diese niedrige TCR-Affinität erklären helfen, warum T-Zellen are natürlich nicht wirksam bei Krebs zu löschen. Hochauflösende atomaren Strukturen von Komplexen zwischen Anti-Krebs-TCRs und verwandtes Tumorantigene beginnen, die molekulare Basis für diese schwache Affinität zu offenbaren. Darüber hinaus sind diese Studien nützlich für die Mechanismen zu bestimmen , die die therapeutischen Interventionen zu Grunde liegen ausgelegt , dieses Problem zu überwinden, zukünftige Verbesserungen 16 Aussaat. In dieser Studie untersuchten wir die erste Struktur eines natürlich vorkommenden αβTCR in Komplex mit einem gp100 HLA-A * 0201-restringierte Epitop Melanomen. Die Struktur, die in Kombination mit einer eingehenden biophysikalischen Untersuchung ergab die Gesamtbindungsmodus der Interaktion. Wir aufgedeckt auch einen unerwarteten molekularen Schalter, die in einer mutierten Form des Peptids aufgetreten ist , die TCR – Bindungs außer Kraft gesetzt (beurteilt Oberflächenplasmonenresonanz verwendet wird ) und CD8 + T-Zell – Erkennung (funktionelle Experimente). Es war nur möglich, diesen neuen Mechanismus der HLA-Antigen presentati nachzuweisenauf die hochauflösenden Methoden beschrieben ist.

Zukünftige Anwendungen oder Richtungen nach dieser Technik zu meistern
Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, die die Macht der Röntgenkristallographie und biophysikalische Methoden, wenn sie mit robusten Funktionsanalysen kombiniert. Mit diesen Ansätzen ist es möglich, präzise molekulare Mechanismen zu sezieren aus, die T-Zell-Antigenerkennung regeln. Tatsächlich ist es auch möglich , diesen Ansatz zu verwenden , um die Struktur von unligierte TZR zu lösen, was zeigt , wie Konformationsänderungen 49 eine Rolle bei der Antigen Diskriminierung spielen können, 50, 51. Ein besseres Verständnis der hochkomplexen und dynamischen Natur, die auch offensichtlich Auswirkungen auf die Therapie-Design hat TCR-pHLA Wechselwirkungen untermauert. Die Möglichkeit, direkt "sehen" die Moleküle, die therapeutisch gezielt, sowie den Effekt, dass Änderungen haben auf Antigen recognitio werdenn, wird deutlich, die Entwicklung dieser Medikamente verbessern die Zukunft. In dieser Studie zeigen wir, dass auch Änderungen in einem einzigen Peptidrest, der von einem TCR nicht stark unvorhersagbar eingreift strukturelle Änderungen an anderen Resten in der HLA-gebundene Peptid übertragen kann, die wiederum T-Zell-Erkennung drastisch verändert. Ein vollständigeres Verständnis der molekularen Mechanismen bei der Erkennung wird T-Zell-Antigen eingesetzt werden sehr vorteilhaft, wenn zukünftige Therapien für eine Vielzahl von Krankheiten beim Menschen zu entwerfen.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

BM wird von einem Cancer Research UK PhD studentship unterstützt. AG wird von einem Life Science Research Network Wales PhD studentship unterstützt. VB wird von einem Krebsforschungs Wales PhD studentship unterstützt. DKC ist ein Wellcome Trust Forschung Career Development Fellow (WT095767). AKS ist ein Investigator Wellcome Trust. GHM wird von einem Joint Life Science Research Network Wales und Tenovus Cancer Care PhD Studentship finanziert. Wir danken dem Personal an der Diamond Light Source für Einrichtungen und Unterstützung.

Materials

S.O.C. media Invitrogen
Orbi-Safe New Orbit incubator Sanyo
carbenicillin  Sigma
IPTG  Fisher
Quick Coomassie Stain SafeStain  Generon
Legend RT centrifuge  Sorvall
Tris  Fisher
magnesium chloride  Arcos
NaCl  Fisher
glycerol  Sigma-Aldrich
Sonopuls HD 2070  Bandelin
DNAse  Fisher
Triton Sigma-Aldrich
EDTA  Fisher
guanidine  Fisher
NanoDrop ND1000  Thermo
Peptides Peptide Protein Research
dithiothreitol  Sigma-Aldrich
L-arginine  SAFC
cysteamine  Fisher
cystamine  Fisher
dialysis tubing  Sigma-Aldrich
urea  Sigma-Aldrich
Metricel 0.45 μm membrane filter Pall
POROS 10/100 HQ  Applied biosystems
ÄKTA pure FPLC system  GE Healthcare Life Sciences
10 kDa MWCO Vivaspin 20  Sartorius
10 kDa MWCO Vivaspin 4  Sartorius
Superdex 200 10/300 GL column  GE Healthcare Life Sciences
Phosphate Buffer Saline  Oxoid
BIAcore buffer HBS  GE Healthcare Life Sciences
Biotinylation kit Avidity
BIAcore T200 GE Healthcare Life Sciences
CM5 chip coupling kit GE Healthcare Life Sciences
streptavidin  Sigma-Aldrich
Microcal VP-ITC  GE Healthcare Life Sciences
Hepes  Sigma-Aldrich
Gryphon crystallisation robot Art Robbins Instruments
Intelli-plate  Art Robbins Instruments
Crystallisation screens and reagents Molecular Dimensions
75 cm2 flask  Greiner Bio-One
0.22 μm filters Miller-GP, Millipore
Ultra-Clear ultracentrifuge tube  Beckman Coulter
Optima L-100 XP with SW28 rotor Beckman Coulter
CD8 microbeads  Miltenyi Biotec
anti-CD3/CD28 Dynabeads  Invitrogen
anti-PE microbeads  Miltenyi Biotec
CK medium, PHA Alere Ltd
anti-TCRVβ mAb  BD
dasatinib  Axon
MIP-1β and TNFα ELISA  R&D Systems
 51Cr  PerkinElmer
1450 Microbeta counter PerkinElmer
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MacLachlan, B. J., Greenshields-Watson, A., Mason, G. H., Schauenburg, A. J., Bianchi, V., Rizkallah, P. J., Sewell, A. K., Fuller, A., Cole, D. K. Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens. J. Vis. Exp. (120), e54991, doi:10.3791/54991 (2017).
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