Summary

Ensayo de citometría de flujo de base para la supervisión de funciones de las células NK

Published: October 30, 2016
doi:

Summary

Un método sencillo y fiable se describe aquí para analizar un conjunto de funciones de las células NK, tales como la desgranulación, de citoquinas y la producción de quimioquinas dentro de los diferentes subconjuntos de células NK.

Abstract

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

Introduction

Como parte del sistema inmune innato células asesinas naturales (NK) contribuyen a la primera línea de defensa contra las células infectadas por virus o malignamente transformadas. Un sistema de receptores inhibidores y activadores les permite distinguir entre las células sanas y transformadas sin cebado antígeno antes en contraste con las células T. Al encuentro célula diana células NK liberan el contenido de sus gránulos citotóxicos (por ejemplo, perforina, granzimas) en la sinapsis inmune para matar a su objetivo. Por otra parte, las células NK producen y secretan diferentes tipos de citoquinas (por ejemplo, gamma interferón: IFN-γ; factor de necrosis tumoral-α: TNF-α) y quimiocinas (por ejemplo, proteína inflamatoria de macrófagos-1β: MIP-1 beta) sobre la célula diana interacción o citoquina estimulación 1.

suficientes funciones de las células NK, tales como citotoxicidad, quimioquinas y la producción de citoquinas tienen un impacto importante en el destino de diversas disalivia. Los pacientes con leucemia muestran un aumento de las tasas de recaída si presentan un perfil de las células NK defectuosa al momento del diagnóstico que consiste en reducción de la producción de IFN-γ y la reducción de la expresión de la activación de los receptores de células NK 2. Una recuperación temprana del número de células NK y la función, incluyendo la producción de citocinas tras la interacción célula diana está asociada con una recaída reducida y una mejor tasa de supervivencia en pacientes que reciben un trasplante de células madre alogénicas 3. Por otra parte, al iniciar la terapia con interferón en pacientes infectados por el virus de la hepatitis C la capacidad de la desgranulación de las células NK periféricas es más fuerte en los primeros respondedores que en los no respondedores 4. El número de células NK (> 80 / l) en el día 15 después del trasplante autólogo de células madre (autoSCT) en pacientes que padecen linfoma o mieloma múltiple son predictivos de la progresión de una mejora de la supervivencia global y libre de 5. En pacientes con melanoma la expresión de la célula T immunoglobulin- y mucina-dominio-containing molécula-3 (TIM-3), una proteína inmunorreguladora en las células NK, se correlaciona con la etapa de la enfermedad y el pronóstico 6.

Los científicos han monitoreado funciones de las células NK en las últimas décadas. El análisis inicial de la citotoxicidad de las células NK contra las células tumorales sin imprimación previa se abordó usando un ensayo de liberación de 51Cr 7. Más recientemente, los científicos desarrollaron un método no radiactivo para evaluar la citotoxicidad de las células NK expandido 8. La producción de citocinas y quimiocinas se ha evaluado con frecuencia usando el ensayo de inmunoabsorción (ELISA) técnicas ligados a enzimas 9,10. Durante las últimas décadas estos métodos han sido complementados por ensayos basados ​​en citometría de flujo. El uso de inhibidores de la proteína de transporte (por ejemplo, brefeldina A y la monensina) y los métodos de permeabilización de células en combinación con protocolos de tinción de superficie convencionales han permitido a los científicos estudiar de quimioquinas y la producción de citoquinas en diferentes linfático específicosubconjuntos ocyte (por ejemplo, T, B o células NK) 11. Por otra parte, los ensayos basados ​​en citometría de flujo diferente se han desarrollado para monitorizar T y NK citotoxicidad de las células. En 2004 Alter et al. Describe la expresión en la superficie de la proteína asociada a lisosoma CD107a (Lamp1) en las células NK en encuentro célula diana como un marcador para la desgranulación de gránulos citotóxicos 12. Dado que una amplia gama de diferentes fluorocromos y citómetros de flujo de múltiples canales están disponibles en nuestros días, se ha hecho posible para monitorear simultáneamente diversas funciones de las células NK (citotoxicidad, producción de citoquinas y quimioquinas) en diferentes subconjuntos de células NK. Esto es especialmente importante en situaciones donde el tamaño de la muestra es limitado, por ejemplo, en las biopsias o muestras de sangre de pacientes que sufren de leucopenia.

Para probar las funciones globales de células NK, los ensayos basados ​​en citometría de flujo diferente se pueden combinar de manera eficiente. Theorell et al. Las células NK estimuladas de headonantes lthy con la línea de células tumorales K562 y analizada la producción desgranulación de las células, y la señal de quimiocina de dentro a fuera NK a través de citometría de flujo 13. Recientemente subgrupos de células NK, fenotipos y funciones en pacientes con tumor durante autoSCT se analizaron mediante citometría de flujo ensayos basados. Se demostró que las células NK fueron capaces de degranulación y producir citocinas / quimiocinas sobre el reconocimiento de células tumorales en puntos de tiempo muy tempranos después de autoSCT 11.

Aquí se describe un protocolo para evaluar las funciones de células NK tras la interacción con las células tumorales, incluyendo la capacidad de la desgranulación, quimioquinas y la producción de citoquinas utilizando un flujo ensayo basado en citometría-que hace que sea posible controlar las funciones de las células NK en diferentes subconjuntos de forma simultánea.

Protocol

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones del comité de ética local de la Universidad de Frankfurt. 1. El cultivo de células K562 Células de cultivo K562 en medios R10 (RPMI 1640 con medio de glutamina, 1% de penicilina / estreptomicina, 10% de suero de ternera fetal) a una densidad de 0,5-1 x 10 6 células por ml en un matraz de cultivo celular a 37 ° C y 5% de CO 2. Las células K562 cosecha de las 24 horas antes del inicio de un nuevo expe…

Representative Results

La estrategia gating para analizar la desgranulación, citoquinas y quimioquinas producción de toda la población de células NK y tres subconjuntos de células NK diferentes se ilustran en la Figura 1. Los resultados representativos de un donante sano se ilustran en la Figura 2. Las células NK sin ningún estímulo ni producen IFN-γ ni MIP-1β y no expresaron CD107a en su superficie …

Discussion

El método descrito es un método fácil, rápido y fiable para estudiar las funciones de las células NK a partir de muestras de sangre entera de donantes sanos o pacientes. Este método ofrece la gran ventaja de purificar directamente a las células NK de la sangre entera, evitando el tiempo de centrifugación en gradiente de densidad, que es obligatorio para muchos otros métodos de purificación 15. Por otra parte, se requiere un tamaño de muestra más pequeño en comparación con métodos de enriquecimi…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Authors were supported by the German Cancer Aid (Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe; EU), the LOEWE Center for Cell and Gene Therapy Frankfurt (EU, ST) funded by the Hessian Ministry of Higher Education, Research and the Arts, Germany (III L 4- 518/17.004) and by the “Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung”, Frankfurt, Germany (EU). BJ was funded by a Mildred Scheel postdoctoral scholarship from the Dr. Mildred Scheel Foundation for Cancer Research. ST was founded by a GO-IN postdoctoral fellowship (PCOFUND-GA-2011-291776). The authors thank Becton Dickinson (BD) for providing the FACSCanto II and Canto10c Flow Cytometry Analyzers used in this study.

Materials

RPMI 1640 + glutamine Invitrogen 6187-044
penicilin/streptomycin Invitrogen 15140-122
BD Falcon Round Bottom Tube BD 352008
fetal calf serum Invitrogen 10270-106 heat inactivated before use
T-flask Greiner Bio-One 690195
K562 tumor cell line DSMZ GmbH ACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer made in house / components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1000ml Plastipur Fresenius Kabi 1088813
Megafuge 40R Centrifuge Heraeus /
EDTA blood collector tubes Sarstedt 386453 S-Monovette 7,5 ml, K3 EDTA
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Hematopoietic media (XVIVO) Lonza Group Ltd BE04-743Q
human serum DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M  / healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright line Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. 0640030/ 1110000
trypan blue solution (0,4%) Invitrogen 15250-061
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies  07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates Corning  3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates Corning  351177
DPBS (Ca2+– and Mg2+-free) Gibco Invitrogen 14190-169
BSA Sigma Aldrich A2153-100G
NaN3 Sigma Aldrich 08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Merck 524400-1MG
ionomycin  PromoKine PK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15) PeproTech 200-15
Proleukin S (IL-2)  Novartis Pharma 730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD Biosciences 554724 This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) BD Biosciences 555029
paraformaldehyde AppliChem UN2209
saponin Sigma Aldrich 47036
flow cytometer: Canto10C BD Biosciences /
FlowJo TreeStar Inc. /
Graph Pad Graph Pad Inc. /
MACSxpress Separator Miltenyi Biotec  130-098-308
MACSxpress NK isolation kit Miltenyi Biotec  130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human Miltenyi Biotec  130-098-196
MACSmix Tube Rotator  Miltenyi Biotec  130-090-753
anti-human CD3 APC Biolegend 300412
anti-human CD3 V450 BD Biosciences 560366
anti-human CD14 PerCP Miltenyi Biotec  130-094-969
anti-human CD14 V450 BD Biosciences 560349
anti-human CD16 PE Biolegend 302008
anti-human CD16 PerCP Biolegend 302029
anti-human CD19 PE-Cy7 Biolegend 302216
anti-human CD19 V450 BD Biosciences 560353
anti-human CD45 BV510 BD Biosciences 563204
anti-human CD56 FITC Biolegend 345811
anti-human CD107a PE Biolegend 328608
anti-human IFN-γ AF-647 BD Biosciences 557729
anti-human MIP-1β APC-H7 BD Biosciences 561280
DAPI Biolegend 422801
Zombie Violet Fixable Viability Kit Biolegend 423113 fixable dead cell marker

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Citer Cet Article
Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J. Vis. Exp. (116), e54615, doi:10.3791/54615 (2016).

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