Summary

Cytométrie de flux à base de test pour la surveillance des cellules NK Fonctions

Published: October 30, 2016
doi:

Summary

Une méthode simple et fiable est décrit ici pour analyser un ensemble de fonctions des cellules NK telles que la dégranulation, la cytokine et la production de chimiokines dans les différents sous-ensembles de cellules NK.

Abstract

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

Introduction

Dans le cadre du système immunitaire inné tueuses naturelles (cellules NK) contribuent à la première ligne de défense contre les cellules infectées par le virus ou malignement transformées. Un système de récepteurs inhibiteurs et activateurs qui leur permet de distinguer entre les cellules saines et transformées sans apprêt préalable de l'antigène, contrairement aux lymphocytes T. Lors de la rencontre de la cellule cible les cellules NK libèrent le contenu de leurs granules cytotoxiques (par exemple, perforine, granzymes) dans la synapse immunitaire de tuer leur cible. En outre, les cellules NK produisent et sécrètent différents types de cytokines (par exemple, gamma interferon: IFN-γ, facteur de nécrose tumorale α: le TNF-α) et de chimiokines (par exemple, macrophage inflammatoire protéine-1β: MIP-1 ß) sur la cellule cible l' interaction ou la stimulation des cytokines 1.

les fonctions des cellules NK suffisantes telles que la cytotoxicité, la chimiokine et la production de cytokines ont un impact important sur le sort des diverses dissoulage. Les patients leucémiques montrent une augmentation des taux de rechute si elles présentent un profil défectueux des cellules NK au moment du diagnostic consistant en une production réduite de l' IFN-γ et une expression réduite d'activation des cellules NK 2 récepteurs. Un redressement rapide du nombre de cellules NK et la fonction , y compris la production de cytokines lors de l' interaction de la cellule cible est associée à une rechute réduite et l' amélioration de taux de survie chez les patients recevant souches allogéniques transplantation de cellules 3. En outre, lors de l' initiation de la thérapie par interféron chez les patients infectés par le virus de l' hépatite C dont la capacité de dégranulation des cellules NK périphériques est plus forte dans les premiers répondeurs que chez les non-répondeurs 4. Le nombre de cellules NK (> 80 / ul) au jour 15 après la transplantation de cellules souches autologues (autoSCT) chez les patients souffrant d' un lymphome ou un myélome multiple sont prédictifs d'une amélioration sans progression et la survie globale 5. Chez les patients souffrant de mélanome l'expression de la cellule T et immunoglobulin- mucine domaine containing molécule-3 (TIM-3), une protéine de régulation immunitaire sur les cellules NK, est en corrélation avec stade de la maladie et le pronostic 6.

Les scientifiques ont suivi les fonctions des cellules NK au cours des dernières décennies. L'analyse initiale de cytotoxicité des cellules NK contre les cellules tumorales sans amorçage préalable a été traitée en utilisant un dosage 51 Cr-release 7. Plus récemment, des chercheurs ont développé un procédé non radioactif pour évaluer la cytotoxicité des cellules NK expansées 8. Cytokine et chimiokine production a souvent été évaluée en utilisant un dosage immuno (ELISA) techniques liés aux enzymes 9,10. Au cours des dernières décennies, ces méthodes ont été complétés par des essais à base de cytométrie en flux. L'utilisation d'inhibiteurs de la protéine de transport (par exemple, la monensine et la brefeldine A) et des procédés de perméabilisation cellulaire en combinaison avec des protocoles de coloration de surface classiques ont permis aux chercheurs d'étudier la chimiokine et la production de cytokines dans différents ganglions spécifiquesous – ensembles de ocyte (par exemple, T, cellules NK B ou) 11. En outre, des dosages à base de cytométrie de flux ont été développés pour surveiller T et la cytotoxicité des cellules NK. En 2004 , Alter et al. , Décrit l'expression de surface de la protéine associée au lysosome CD107a (Lampe 1) sur les cellules NK à la rencontre de la cellule cible en tant que marqueur pour la dégranulation des granules 12 cytotoxiques. Etant donné qu'une large gamme de différents fluorochromes et les cytomètres de flux à canaux multiples sont disponibles de nos jours, il est devenu possible de surveiller simultanément les différentes fonctions cellulaires (NK cytotoxicité, de cytokines et de production de chimiokine) dans différents sous-ensembles de cellules NK. Cela devient particulièrement important dans les situations où la taille de l' échantillon est limitée, par exemple, dans des biopsies ou des échantillons de sang de patients atteints de leucopénie.

Pour tester les fonctions globales de cellules NK, les essais à base de cytométrie de flux différents peuvent être efficacement combinés. Theorell et al. Les cellules NK stimulées de headonateurs lthy avec la lignée cellulaire tumorale K562 et analysé NK dégranulation cellulaire, signal à l' intérieur-out et chimiokine production via cytométrie en flux 13. Récemment des sous-groupes de cellules NK, phénotypes et fonctions chez les patients de tumeur pendant autoSCT ont été analysées à l'aide de flux tests basés sur la cytométrie. Il a été démontré que les cellules NK ont été capables de produire des cytokines et dégranulent / chimiokines sur la reconnaissance des cellules tumorales à des moments très tôt après 11 autoSCT.

Ici, un protocole est décrit pour évaluer les fonctions des cellules NK lors de l'interaction avec des cellules tumorales y compris la capacité de la dégranulation, la chimiokine et la production de cytokines à l'aide d'un flux de dosage basé sur une cytométrie qui permet de contrôler les fonctions des cellules NK dans les différents sous-ensembles simultanément.

Protocol

Cette étude a été réalisée en conformité avec les recommandations du comité d'éthique local de l'Université de Francfort. 1. Culture de cellules K562 La culture de cellules K562 en R10 (Media RPMI1640 avec du milieu de glutamine, 1% de pénicilline / streptomycine, 10% de sérum de veau foetal) à une densité de 0,5-1 x 10 6 cellules par ml dans un flacon de culture cellulaire à 37 ° C et 5% de CO 2. Récolte des cellules K562 24 h Avant le début d&…

Representative Results

La stratégie d'ouverture de porte pour analyser la dégranulation, la production de cytokines et chimiokines de l' ensemble de la population de cellules NK et de trois sous – ensembles de cellules NK différentes sont illustrés sur la figure 1. Des résultats représentatifs d'un donneur sain sont illustrés sur la figure 2. Les cellules NK sans stimulation produites ni IFN…

Discussion

La méthode décrite est une approche facile, rapide et fiable pour étudier les fonctions des cellules NK à partir d'échantillons de sang total de donneurs sains ou de patients. Ce procédé offre le grand avantage de purifier directement les cellules NK dans le sang total, en évitant le temps centrifugation en gradient de densité, qui est obligatoire pour de nombreux autres procédés de purification 15. En outre, il nécessite une plus petite taille de l'échantillon par rapport à des procéd?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Authors were supported by the German Cancer Aid (Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe; EU), the LOEWE Center for Cell and Gene Therapy Frankfurt (EU, ST) funded by the Hessian Ministry of Higher Education, Research and the Arts, Germany (III L 4- 518/17.004) and by the “Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung”, Frankfurt, Germany (EU). BJ was funded by a Mildred Scheel postdoctoral scholarship from the Dr. Mildred Scheel Foundation for Cancer Research. ST was founded by a GO-IN postdoctoral fellowship (PCOFUND-GA-2011-291776). The authors thank Becton Dickinson (BD) for providing the FACSCanto II and Canto10c Flow Cytometry Analyzers used in this study.

Materials

RPMI 1640 + glutamine Invitrogen 6187-044
penicilin/streptomycin Invitrogen 15140-122
BD Falcon Round Bottom Tube BD 352008
fetal calf serum Invitrogen 10270-106 heat inactivated before use
T-flask Greiner Bio-One 690195
K562 tumor cell line DSMZ GmbH ACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer made in house / components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1000ml Plastipur Fresenius Kabi 1088813
Megafuge 40R Centrifuge Heraeus /
EDTA blood collector tubes Sarstedt 386453 S-Monovette 7,5 ml, K3 EDTA
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Hematopoietic media (XVIVO) Lonza Group Ltd BE04-743Q
human serum DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M  / healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright line Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. 0640030/ 1110000
trypan blue solution (0,4%) Invitrogen 15250-061
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies  07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates Corning  3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates Corning  351177
DPBS (Ca2+– and Mg2+-free) Gibco Invitrogen 14190-169
BSA Sigma Aldrich A2153-100G
NaN3 Sigma Aldrich 08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Merck 524400-1MG
ionomycin  PromoKine PK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15) PeproTech 200-15
Proleukin S (IL-2)  Novartis Pharma 730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD Biosciences 554724 This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) BD Biosciences 555029
paraformaldehyde AppliChem UN2209
saponin Sigma Aldrich 47036
flow cytometer: Canto10C BD Biosciences /
FlowJo TreeStar Inc. /
Graph Pad Graph Pad Inc. /
MACSxpress Separator Miltenyi Biotec  130-098-308
MACSxpress NK isolation kit Miltenyi Biotec  130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human Miltenyi Biotec  130-098-196
MACSmix Tube Rotator  Miltenyi Biotec  130-090-753
anti-human CD3 APC Biolegend 300412
anti-human CD3 V450 BD Biosciences 560366
anti-human CD14 PerCP Miltenyi Biotec  130-094-969
anti-human CD14 V450 BD Biosciences 560349
anti-human CD16 PE Biolegend 302008
anti-human CD16 PerCP Biolegend 302029
anti-human CD19 PE-Cy7 Biolegend 302216
anti-human CD19 V450 BD Biosciences 560353
anti-human CD45 BV510 BD Biosciences 563204
anti-human CD56 FITC Biolegend 345811
anti-human CD107a PE Biolegend 328608
anti-human IFN-γ AF-647 BD Biosciences 557729
anti-human MIP-1β APC-H7 BD Biosciences 561280
DAPI Biolegend 422801
Zombie Violet Fixable Viability Kit Biolegend 423113 fixable dead cell marker

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Citer Cet Article
Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J. Vis. Exp. (116), e54615, doi:10.3791/54615 (2016).

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