Polarize TIRF Mikroskopi tarafından İzlenen mikroakışkan Akış Hücredeki Gergin Desteklenen Bilayers Tek Proteoliposomes ve tuzak aracılı Fusion

Membran füzyon lipidler ve proteinler, sekresyon, gübreleme, gelişme hücre içi kaçakçılığı için gerekli evrensel bir biyolojik süreçtir ve konak organizmalar ^1-3 içine virüs girişini sardı. Ekzositoz ile hormonlar ve nöron iletici serbest bırakılması da dahil olmak üzere pek çok hücre içi füzyon reaksiyonları için, iki lipit iki katmanlı sigorta enerji demirli, aynı kökenli çözünür, N-etilmaleimit duyarlı faktörü bağlama proteini reseptörü (SNARE) proteinleri arasında dört sarmal demet oluşumu ile sağlanır vezikül (V-SNARE), sırasıyla, hedef membran (t-SNARE) ^4. Sinaptik vezikül ekzositoz en sıkı regüle füzyon reaksiyonudur ve bir aksiyon potansiyeli ^1,4,5 geldikten sonra bir milisaniye içinde gerçekleşir. Füzyon gözenek, iki füzyon bölmeleri arasında ilk bağlantı, açık titreşmeye ve yeniden mühürleme ya da geri dönüşümsüz ^5-7 genişletmeden önce birden çok kez kapalı olabilir. eski sonuçlargeçici olarak, ikincisi yol açar iken tam füzyon, füzyon "öpücük ve çalıştırın". Bu iki füzyon modları ve gözenek titremesini düzenleyen mekanizmalar arasındaki dengeyi düzenleyen faktörler de ^5,8 anlaşılmamıştır.

Snare proteinler ekzositoz için gerekli olan; sinaptik vezikül füzyon nörotoksin ⁹ ile tuzaklarına ayrılması üzerine kaldırılmıştır. Küçük tek lamelli vesiküller (SUVler) kullanılarak yığın füzyon deneyleri membran füzyon ¹⁰ çalıştırmak için yeterli tuzak, sadece gerekli değildir; ancak şu. Bu toplu deneyde, SUV V-tuzak (V-SUV) ile yeniden flüoresan fosfolipid (N katkılı edildi – (7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-il) -phosphoethanolamine (NBD-PE) ve ( N -. (lisamin rodamin B sülfonil) -phosphoethanolamine (LR-PE) ve V-SUV NBD-PE Başlangıçta floresans Förster rezonans enerji transferi ile söndürüldü t-tuzak (t-SUV) ihtiva eden etiketlenmemiş veziküller ile (FRET ) LR-PE. laboratuvarda gibiELED v SUV etiketsiz t-SUV ile sigorta, şimdi kombine zarında fluorofor yüzey yoğunluğu azalır ve NBD-PE floresan sonuçlanan artış lipit ¹⁰ karıştırma ölçüde bildirir. Toplu tahlil kurmak ve analiz etmek kolay olduğu gibi, yaygın tuzak aracılı füzyon ^10-14 mekanizmaları incelemek için kullanılır olmuştur. Ancak, bu düşük duyarlılık ve kötü zaman çözünürlüğü gibi çeşitli sınırlamalar vardır. En önemlisi, bir topluluk ölçü olarak, zor hemifusion ara maddelerin yerleştirme ve füzyon arasındaki ayrım, yanı sıra algılama yaparak tüm olaylar üzerinde bu ortalamalara sonuçları.

Bizimki de dahil olmak üzere geçmiş on yılda birkaç grup, üzerinde, tek vezikül düzeyinde ^15-27 füzyon olayları izlemek için yeni testlerin geliştirdik. Ha ve arkadaşları bir yüzey üzerine gergin v SUV kullanılan ve ücretsiz t-SUV ^18,19 ile füzyon izlenir. Lipid karıştırma lipide bağlı flüoroforların bir çifti arasında FRET kullanılarak izlenmiştir emtoplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi ¹⁸ kullanılarak, sırasıyla V- ve t-SUV, içinde yataklı. Daha sonra, Brünger laboratuar lipit içeriği ^20,28 karıştırma eş zamanlı saptanması için bir dizin işaretleyici ile birlikte tek bir lipit etiketli türler kullanılabilir. lipit ve içerikleri belirteçleri hem de yüksek, kendini söndürme konsantrasyonlarda dahil edildi; etiketlenmemiş SUV füzyon ^20,28 dequenching floresan ile sonuçlanmıştır.

Diğerleri t-tuzaklarına ^{15-17,21-27,29} ile yeniden düzlemsel bilayers v-SUV kaynaşmış. hedefin (içeren t-Snare) iki tabakalı iyi taklit düz bir plazma zarı ile küçük, son derece kavisli veziküllerin fizyolojik füzyon süreci düzlemsel geometrisi. Steinem grubu gözenekli silisyum nitrür alt-tabaka üzerinde süspansiyon haline t-tuzak ile yeniden gözenek kapsayan membranlar kullanılabilmekte ve konfokal lazer tarama mikroskobu ²³ kullanılarak tek tek h-SUV ile füzyon tespit edildi. Diğerleri ft-tuzak ile yeniden düzlemsel iki katmanlı, kullanılmış h-SUV bir cam alt-tabaka ^{15-17,21,22,24-27,29} desteklenir. Desteklenen bilayers (SBLs) kullanarak büyük avantajı mikroakışkanları kullanarak da kullanarak tek olay çözünürlüğü sağlar, ancak TIRF mikroskopi, mükemmel sinyal-gürültü oranı ile ücretsiz v-SUV müdahalesi olmaksızın yerleştirme ve füzyon olayları tespit etmek için kullanılabilir olmasıdır standart uzak alan Epifloresans mikroskobu ^24.

Bir büyük endişe substrat-iki tabakalı etkileşimleri iki tabakalı kalitesi ve füzyon süreci desteklenen etkiler ve nasıl olduğunu. Erken çalışma, doğrudan bir cam veya kuvars alt tabaka ^15-17 desteklenen edildi düzlemsel SBLs kullandı. Bu SBLs yayma ve alt-tabaka t-SUV membran füzyonu, patlama, adsorpsiyon ile yapılmıştır. Kısa bir süre sonra önemli bir T-SNARE bileşenini çıkararak SNAP-25'in bu şekilde hazırlandı SBLs V-SUV yerleştirme füzyon kinetiği indistinguis sonuçlandı ki, gerçekleşmiştirtam t-tuzaklarına ¹⁷ kullanılarak elde edilenlerden hable. SNAP-25'in kesinlikle vivo ^30,31 füzyon için gerekli olduğundan, bu erken girişimleri fizyolojik alaka soru konulmuştur. Tamm grubu daha iyi desteklenen kontrollü iki tabakalı oluşumunu ²¹ kullanarak bu zorluğu aştı. Bu t-SUV ²¹ ile bu tek tabakalı füzyonu tarafından takip SBL protein içermeyen ilk broşürü için Langmuir-Blodgett birikimi kullanılır. Bu SNAP-25'in bağımlı füzyon ile sonuçlanmıştır.

Şirketinden Langmuir-Blodgett yöntemleri kullanmaya gerek kalmadan, bir cam alt-tabaka üzerinde desteklenen bir çift-katlı ile bağlantılı potansiyel eserler önlemek için, Karatekin'i ve ark., Çift-katlı ve alt-tabaka ²⁴ ile yumuşak, hidratlanmış poli (etilen glikol) (PEG) yastık kişiye. Bu modifikasyon aynı zamanda SNAP-25'in bağımlı füzyon ²⁴ sonuçlandı. yumuşak bir polimer tabakası üzerinde yastıklı bilayers daha iyi transmembran korumak için malûmProtein hareketlilik ve fonksiyon ^32, ve virüsler ³³ ile füzyon çalışmalarında kullanılan olmuştu. Buna ek olarak, PEG'lenmiş bilayers-iyileşmek kendini bazı yeteneğini korumak gibi görünüyor ve ^34,35 derece sağlamdır. İlk olarak, ticari olarak temin edilebilir, lipid bağlı PEG zincirlerinin bir kısmı, t-SUV zar dahildir. Bu T-SUV patlama ve bir cam alt-tabaka üzerinde düzlemsel bir çift tabakası oluşturur, PEG fırçası düzlemsel iki katmanlı iki broşür içerir. düzlemsel bir iki tabakalı oluşum hidrofilik bir cam yüzeyi üzerine, T-SUV Çevre PEG zincirlerinin yapışma tahrik sayesinde, lipozom patlama ve düzlemsel iki katmanlı oluşum şeklinde kullanılan yağ bileşimine nispeten hassas değildirler. kolesterol büyük miktarlarda dahil edilir, ancak, SUV kohesif özelliklere artan, SUV kendiliğinden patlama olabilir. Bu durumda, ozmotik şok ve çift değerli iyonlar, düzlemsel bir iki tabakalı oluşum ²⁵ yardımcı olarak kullanılabilir.

Bu ap olarak, yukarıda da belirtildiği gibiPEG fırçası düzlemsel her iki tarafını da kapsar yaklasımlarında iki tabakalı desteklenir. mikroakışkan akış kanalı bakan fırçası, genellikle, bir PEG tabakası ile kaplanmış olan gelen V-SUV spesifik olmayan yapışmasını önlemeye yardımcı olur. V- ve t-Snare komplekslerinin oluşumu zara yakın etki ³⁶ doğru kademeli olarak zara-uzak N-termini ve gelirleri başlar. v-SUV t-SBL, V ve tayinin koşulları altında durum gibi görünüyor PEG fırçalar, üzerinde çıkıntı t-tuzak N-termini ihtiyacı ile etkileşim için. Fırça yüksekliği PEG'lenmiş lipidlerin yoğunluğu ve PEG bağ uzunluğunun gösterildiği ^37,38 değiştirilerek tuzak dışındaki proteinlerin incelemek için adapte edilebilir. Füzyon iki katmanlı proksimal yüzeyleri kaplayan PEG fırçalar başka yararı da meydanda mikron ³⁹ başına 30,000-40,000 integral membran proteinleri ile paketlenir biyolojik membranların kalabalık ortamı taklit olmasıdır. Sadece bu testte PEG zincirleri gibi, Repubiyolojik zarlardan kapsayan lsive protein tabakası füzyonu meydana gelmesi için, iki fosfolipid ikili tabakalar arasındaki temas sağlamak için bir kenara gerekmektedir.

bunlar özel avantajlar sunar olarak mikroakışkan akış kanalları, bu deneyde kullanılır. İlk olarak, mikro-akışkan akış t-SBL oluşturulması için daha düzgün yayılması için T-SUV çökelmesini ve sigorta sağlar. İkincisi, küçük kanal hacmi (<1 ul) örnek tüketimini en aza indirir. Üçüncü olarak, gerekli küçük hacimler, tüm deney sürekli akışı altında iletilmesine olanak tanımaktadırlar. Akış zayıf kaldırır, muhtemelen non-spesifik, SBL ¹⁶ yapıştırılır v-SUV. Ayrıca, kinetik analiz ¹⁷ basitleştirilmesi t-SBL Yukarıda h-SUV, sabit bir yoğunluğa tutar. Son olarak, demirledi kesecikler kolaylıkla akışı ²⁵ tarafından taşınan serbest olanlardan ayırt edilir. Dördüncü olarak, çok sayıda mikroakışkan kanal her biri farklı bir durum tarama aynı lamel kullanılabilir. Bu koşullar Duri karşılaştırılmasına olanak sağlarAynı deney çalıştırmak ng. Benzer bir yaklaşım influenza virüsü ve yastıklı SBLs ³³ arasında füzyon incelemek için van Oijen grubu tarafından kullanılmaktadır.

TIRF mikroskopi, cam tampon arayüzü çok yakın olan bu moleküllere sınırlandırır floresan uyarma (bir çürüme sabit ~ 100 nm) ile yiten alanın üstel çürüme. Bu, daha uzak olan floresan moleküller katkısını en aza indirir sinyal-gürültü oranını artırır ve 10-40 milisaniye çerçeve pozlama süreleri ile tek bir molekül hassasiyeti sağlar. fani alanı da füzyon üzerine bir sinyal artışına neden olur: SBL içine SUV etiketli lipidler transferi gibi, kendilerini bulmak, ortalama olarak, daha güçlü bir uyarım alanında. floresanstaki bu artış daha büyük lipozomlar için kuvvetlidir.

polarize ışık kaybolan alan üretmek için kullanılırsa, ilave özellikler t üzerine floresanstaki değişikliklere katkıdaSBL içine SUV etiket ransfer. Bazı lipid boyalar da gömülü olduğu çift-katlı göre bir tercih edilen ortalama açı ile yönlendirilmiş bir geçiş dipol sahiptir. Polarize ışın farklı iki zarlarında boyalar heyecanlandıracak çünkü bu, onlar SBL karşı SUV olduğunda fluorophores tarafından yayılan floresan miktarında bir fark yaratmaktadır. ikincisi için, dipol yönelimleri düz SBL geometri ile sınırlı olacak, oysa eski için, uyarma kiriş, küresel SUV etrafında odaklı geçiş dipol ile etkileşim olacaktır. Boya zar ^29,40 bir lipit, boya geçişi dipol yönelimli paralel SUV daha SBL olduğunda, örneğin, S-polarize (yansıma düzlemine dik polarize) gelen ışık kullanıldığında, uyarım daha etkilidir (örneğin, DII bu veya yaptıkları ^41-43 gibi). Böyle bir fluorofor ile katkılı bir SUV loş göründüğünde SBL (Şekil 7, representat üzerine bu rıhtım ) Sonuçları ive. Bir füzyon gözenek açılır ve SUV ve SBL membranlar bağlayan gibi, floresan sondalar SBL nüfuz ve s-polarize kaybolan alanda ^25,27,29 tarafından heyecan daha olası hale gelir. Sonuç olarak, füzyon site çevresinde entegre floresans sinyali SBL ²⁷ (Şekil 3 ve Şekil 7) içine SUV boya transferi sırasında büyük oranda artar. SBL aktarılır zaman seyreltilmiş olarak füzyon floresan etiket dequenching olduğunu eşlik değişiklikleri sinyal katkıda ek bir faktör. dequenching katkısı nedeniyle sadece küçük bir kısmı (burada anlatılan deneyde kaybolan alan çürüme ve polarizasyon etkileri ile karşılaştırıldığında genellikle önemsizdir ) Lipidlerin etiketlenmiştir.

füzyon üzerine sinyal artışı zamanı karşılaştırarak füzyon gözenek özelliklerini anlamak için kullanılabilir,1 "src =" / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg "/>, bir lipit fiili bırakma süresi lipidler serbestçe geçirgen bir gözenek yoluyla kaçmak için gerekli olan, . İki zaman ölçekleri karşılaştırılabilir ise, gözenek lipit akışına çok az direnç sunar sonucuna olacaktır. Gerçek serbest bırakma süresi daha uzun difüzyon ile sınırlı serbest bırakılması için zaman önemli ölçüde ise, ancak, bu lipit salgılamayı geciktiren, bu gözenek titremesi gibi bir işlem işaret eder. Difüzyon sınırlı bırakma zamanı, , Fırınlama lipozom ve lipid-yayılma büyüklüğüne bağlıdır; onun tahmini bu iki parametre sayısal gerektirir. Testin tek bir molekülün duyarlılık lipit yayınım her füzyon olayı ²⁶ için SBL onların serbest bırakıldıktan sonra birkaç tek lipit fluorophores takip ölçülebilir sağlar. Her füzyon vezikül büyüklüğü(i) tek bir lipid boyanın yoğunluğu, SUV (ii) tüm flüoroforlar füzyon üzerine SBL aktarılır sonra yerleştirme site çevresinde toplam parlaklıkta meydana gelen değişiklikler (III) bilinen bir etiketleme yoğunluğu birleştirilerek ²⁷ tahmin edilebilir lipitler, ve (iv) lipit alan başına. Üniforma SUV boyutu ⁴⁴ varsayarak Daha önce de belirtildiği gibi birçok füzyon etkinlikleri için gerçek lipit bırakma süreleri, difüzyon kontrollü salım ²⁷ tarafından beklenenden çok daha yavaş olduğu tespit edildi. Lipid sürümü geriliği varsayarsak titremeyi gözenek nedeniyle, nicel bir model "gözenek açıklık" tahmin edilebilir, zaman kesir gözenek füzyonu ²⁷ boyunca açık kalır.

Ne zaman pratik, lipid ve çözünür içeriği etiketleri her ikisini de kullanarak füzyon mekanizmaları test etmek önemlidir. Örneğin, lipit bırakma gibi Snare proteinler Surround ton lipit difüzyon kısıtlanması olarak gözenek titremesi başka süreçler tarafından geciktirilebilir olabilirO gözenek. Bu durumda olsaydı, o zaman, lipit etiket salınmasını önce olur içeriğinin serbest boşluk çözünebilir problar geçişine izin verecek kadar büyük olması gereklidir. yaklaşımı daha temel bir kusur SBL etiketli lipitlerin transferi büyük ölçüde öncesi füzyon şeklini korudu bir kesecik için SBL bağlayan dar bir füzyon gözenek yoluyla gerçekleşir varsayım olabilir. Daha önce lipit bırakma verilerine yalnız ²⁹ dayalı önerdi olarak SBL içine lipid transfer de, bir eşlik eden füzyon gözenek, SBL membran içine SUV son derece hızlı çöküşü hızlı genleşme sonucu olabilir. Her iki lipid İzleme ve içeriği aynı anda bırakın, birçok gözenekler tüm lipit etiketlerini serbest bıraktıktan sonra yeniden mühürlenerek bulundu, ancak kendi çözünür kargo ²⁷ bazı tutuldu. Bu en azından bazı lipozomlar SBL içine lipit boya transferi bir füzyon gözenek yoluyla oluşur birleşmesinden sonra SBL içine çökmeye ve yok olduğunu gösterir. Buna ek olarak, lIPID ve içeriği bırakma lipit sürümü geriliği gözenek ⁴⁵ çevreleyen Snare protein lipid difüzyon engel teşkil nedeniyle olduğunu olmayan, aynı anda ²⁷ oluştu.

Çözünür içeriği serbest izlemek vermedi bir SUV-SBL füzyon protokol daha önce Karatekin ve Rothman ²⁵ tarafından yayımlandı. Burada, daha son gelişmeler dahil lipid yani eşzamanlı izleme ve içerikleri serbest ve SUV, lipit ve füzyon gözenek özellikleri ²⁷ tahmini vardır. Protokol, bir cam lamel ²⁵ bir poli (dimetil siloksan) yapıştırılması ile yapılan mikro-akışkan hücreleri (PDMS) elastomer blok ihtiva eden oluklar hazırlanması için talimatlar ile başlar. Daha sonra, lipid ve içeriği belirteçlerinin her ikisi de V-SUV hazırlanması açıklanmıştır. Bölümler 4 ve 5, VS giriş, mikroakışkan hücre montaj yerinde SBLs şekillendirme ve kusurları ve akışkanlığı kontrol için yönergeler sağlarakış hücreleri füzyon etkinlikleri algılama içine UV'lerinizi. Bölüm 6 Veri analizi için yönergeler sağlar.