SNARE-опосредованного Слияние единого Протеолипосомы с ПРИВЯЗНЫХ Поддержанные Бислои в ячейке Микрожидкостных Flow, отслеживаемых поляризованной TIRF микроскопией

Мембранные слияние является универсальным биологическим процессом , необходимый для внутриклеточного транспорта липидов и белков, секреции, оплодотворение, развитие и окутал запись вируса в организме – хозяине ^1-3. Для большинства реакций внутриклеточного синтеза , включая высвобождение гормонов и нейротрансмиттеров через экзоцитоза, энергия для сплавления двух бислоев обеспечивается образованием четырех-винтового пучка между родственными растворимы N-этилмалеимид-чувствительных рецепторов прикрепление белок фактора (SNARE) белки, закрепленные в везикулы (V-SNARE) и целевой мембрана (трет-SNARE) ^4, соответственно. Synaptic пузырек экзоцитоза является наиболее жестко регулируется термоядерная реакция и происходит в течение миллисекунды после прихода к потенциала действия ^1,4,5. Слияние пор, начальное соединение между двумя дублирующих отсеков, могут мерцать открытые и закрытые несколько раз , прежде чем опечатывания или расширения необратимо ^5-7. Прежние результатыв переходном процессе, "поцелуй и запустить" слияние, в то время последних приводит к полному слиянию. Факторы , определяющие баланс между этими двумя режимами слияния и механизмов , регулирующих пор мелькать недостаточно хорошо изучены ^5,8.

SNARE белки необходимы для экзоцитоза; синаптической слияние везикул упразднены при расщеплении SNAREs нейротоксинами ^9. Массовые эксперименты с использованием слитых небольшие однослойные везикулы (SUV) показал , что SNAREs не только необходимо, но и достаточно , чтобы диск слияние мембран ^10. В этом объемном анализе внедорожников восстанавливали с треугольным SNAREs (V-SUV) легировались флуоресцентных фосфолипидов (N – (7-нитро-2-1,3-benzoxadiazol-4-ил) -phosphoethanolamine (НБД-РЕ) и ( N -. (лиссамин родамина B сульфонил) -phosphoethanolamine (LR-PE) и смешивают с немеченых везикул , содержащих трет-SNAREs (T-SUV) Первоначально флуоресценции NBD-PE в V-внедорожников гасят Форстера резонансного переноса энергии (FRET ) для LR-PE. в лабораторииeled V-внедорожников сливаться с немеченых т-внедорожников, плотность флуорофор поверхности в объединяемых теперь мембраны уменьшается , и в результате увеличения НБД-PE флуоресценции сообщает степень липидного смешивания ^10. По мере того как основная часть анализа легко настроить и анализировать, он широко используется для изучения механизмов SNARE-опосредованного слияния ^10-14. Тем не менее, он имеет ряд недостатков, таких как низкая чувствительность и низким разрешением времени. Самое главное, как совокупность измерений, она составляет в среднем результаты по всем событиям, делающих дискриминацию между стыковке и фьюжн, а также обнаружение hemifusion промежуточных сложных.

За последнее десятилетие несколько групп, в том числе у нас, разработали новые анализы для мониторинга слитые событий на одном уровне везикул ^15-27. Ха и его коллеги использовали V-внедорожники ПРИВЯЗНЫХ на поверхность и контролировать их слияние с бесплатными т-внедорожников ^18,19. Липидный смешивание контролировали с помощью FRET между парой липидных переплете флуорофоров EMутопленным в v- и Т-внедорожников, соответственно, с использованием полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) микроскопии ^18. Позже лаборатория Brunger использовали один вид липидами этикетки вместе с маркером содержание для одновременного определения липидов и содержание смешивания ^20,28. Оба липида и маркеры содержание были включены при высоких, самогасящихся концентрации; слияние с немеченых внедорожников привело к флуоресценции dequenching ^20,28.

Другие слиты V-внедорожников для плоских двухслойных воссозданных с трет-SNAREs ^{15-17,21-27,29.} Плоская геометрия мишени (трет-SNARE, содержащий) двухслойная лучше имитирует физиологический процесс слияния небольших, высоко загнутыми везикул с плоской мембраной плазмы. Группа Стеинем использовали поры мембраны остовного реконструированные с трет-SNAREs, подвешенные над пористой подложке из нитрида кремния и обнаружено слияние с отдельными клиновых внедорожников с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии ^23. Другие Fб клиновые внедорожников в планарный бислоями восстанавливали трет-SNAREs, нанесенный на стеклянную подложку ^{15-17,21,22,24-27,29.} Большим преимуществом использования поддерживаемых бислоя (SBLs) является то, что TIRF микроскопия может быть использована для обнаружения стыковки и фьюжн события с отличным отношением сигнал-шум и без помех со стороны свободных v-внедорожников, хотя использование микрофлюидики также обеспечивает разрешение одного события, используя стандарт дальнего поля эпифлуоресцентной микроскопии ^24.

Одной из основных проблем является, влияют ли и как субстрат-двухслойная взаимодействие поддерживается качество двухслойную и процесс сварки. Ранние работы использовали плоских SBLs, непосредственно нанесенных на стеклянную или кварцевую подложку ^15-17. Эти SBLs были сделаны с помощью адсорбции, распирает, распространение и слияние T-SUV мембраны на подложке. Вскоре стало ясно, однако, что опуская ключевой компонент трет-силки, SNAP-25, из SBLs, полученных таким образом, привело к v-SUV стыковки и слияния кинетики indistinguisHable от полученных с использованием полного трет-SNAREs ^17. Поскольку SNAP-25 абсолютно необходим для синтеза в естественных условиях ^30,31, физиологическая значимость этих ранних попыток была поставлена ​​под сомнение. Группа Тамма преодолели эту проблему, используя более эффективный контроль при поддержке формирования двухслойную ^21. Он использовал осаждение пленок Ленгмюра-Блоджетт для безбелковом первой листке SBL, с последующим слиянием этого монослоя с ^Т-21 внедорожников. Это привело к SNAP-25-зависимого синтеза.

Для того, чтобы избежать возможных артефактов , связанных с бислой поддерживается непосредственно на стеклянной подложке без необходимости использования методов Ленгмюра-Блоджетт, Karatekin и др. Ввели мягкую, гидратированный поли (этиленгликоль) (ПЭГ) подушку между бислой и подложкой ^24. Эта модификация также привело к SNAP-25-зависимого слияния ^24. Бислои подкладкой на мягком полимерном слое было известно лучше сохранить трансмембранныйподвижность белка и функции ^32, и были использованы в слитых исследованиях с вирусами ^33. Кроме того, ПЭГилированные двухслойные , кажется, сохраняют некоторую способность к самовосстановление и являются очень прочными ^34,35. Во-первых, часть коммерчески доступных, липидные-сшитый цепей ПЭГ включены в T-SUV мембраны. Когда эти Т-внедорожники лопаются и образуют плоскую бислой на стеклянной подложке, щетка ПЭГ охватывает как листовки плоского бислой. Поскольку образование планарных бислой обусловлена ​​адгезией цепей ПЭГ, окружающих т-внедорожников на гидрофильной поверхности стекла, липосомами разрывной и образование планарных бислой относительно нечувствительны к липидной композиции, используемой. Однако, когда большое количество холестерина включены, увеличивая липких свойства внедорожников, внедорожники не могут лопнуть спонтанно. Если это так, осмотический ионы ударные или двухвалентные могут быть использованы , чтобы помочь образованию двухслойных планарный ^25.

Как упоминалось выше, в этом аргах щетка ПЭГ охватывает обе стороны плоской, поддерживается бислой. Щетки перед каналом микрожидкостных потока помогает предотвратить неспецифическую адгезию входящих v-внедорожников, которые также, как правило, покрыты слоем PEG. Формирование V- и T-SNARE комплексов начинается с мембранно-дистальный N-концах и протекает в стадии по отношению к мембране проксимальных доменов ^36. Для клиновых внедорожников взаимодействовать с трет-SBL, в v- и трет-SNARE N-концы необходимости выступать над щетками PEG, который, кажется, дело в условиях анализа. Высота щетки может быть адаптирована для изучения отличных SNAREs белков путем варьирования плотности пегилированного липидов и длину ^37,38 ПЭГ – цепи. Еще одно преимущество щеток PEG , охватывающих проксимальные поверхности клеевой бислоев, что они имитируют переполненном окружающую среду биологических мембран , которые упакованы с 30000-40000 интегральными мембранными белками на квадратный микрон ^39. Так же, как и цепей ПЭГ в этом анализе Республики Корlsive белковый слой, покрывающий биологические мембраны должен быть выдвинут в сторону, чтобы обеспечить контакт между двумя фосфолипидных бислоев для слияния, чтобы произойти.

Микрожидком проточные каналы используются в данном анализе, так как они предлагают уникальные преимущества. Во-первых, Микрожидкостных поток обеспечивает более равномерное осаждение Т-внедорожников для распространения и предохранитель, чтобы сформировать Т-SBL. Во-вторых, малый объем канала (<1 мкл) сводит к минимуму потребление пробы. В-третьих, малые объемы, необходимые позволяют весь эксперимент будет проводиться под постоянным потоком. Flow удаляет слабо, по- видимому , неспецифически, прилипшие V-внедорожники от SBL ^16. Он также поддерживает постоянную плотность клиновых внедорожников выше трет-SBL, упрощающих кинетический анализ ^17. И, наконец, стыковка везикулы легко отличить от свободных , переносимых потоком ^25. В-четвертых, несколько микроканалов могут быть использованы в той же покровным, каждый зондировании другое состояние. Это позволяет проводить сравнение условий Дуринг один и тот же экспериментальный прогон. Аналогичный подход был использован группой ван Oijen изучить слияние между вирусом гриппа и уютными SBLs ^33.

В TIRF микроскопии, экспоненциальный распад исчезающего поля (с постоянной распада ~ 100 нм) ограничивает возбуждения флуоресценции тех молекул, которые находятся в непосредственной близости от поверхности раздела стекла и буфера. Это сводит к минимуму вклад флуоресцентных молекул, которые еще дальше, увеличивает отношение сигнал-шум и позволяет одиночной молекулы чувствительности с временем экспозиции кадра 10-40 мс. Затухающих поле также приводит к увеличению сигнала после слияния: в качестве меченого переноса липидов из джипа в SBL, они оказываются, в среднем, в более сильном поле возбуждения. Это увеличение флуоресценции сильнее для больших липосом.

Если поляризованный свет используется для генерации эванесцентной поля, дополнительные эффекты способствуют изменения флуоресценции при Тransfer этикеток из внедорожника в SBL. Некоторые липидные красители имеют дипольный ориентированный с предпочтительным средним углом по отношению к бислой, в котором они включены. Это создает разницу в количестве флуоресценции , испускаемой флуорофоров , когда они находятся в SUV по отношению к SBL, так как поляризованный пучок будет возбуждать красители в двух мембран по- разному. Для первого пучка возбуждения будет взаимодействовать с переходной диполей, ориентированных вокруг сферического SUV, в то время как для последних, ориентации диполей будет ограничена плоской геометрией SBL. Например, при использовании S-поляризованный падающий свет (поляризованный по нормали к плоскости падения), возбуждение является более эффективным , когда краситель находится в SBL , чем в SUV для липидного красителя дипольных ориентированной параллельно мембране ^29,40 (как , например, из DiI или Оказалась ^41-43). Внедорожник , легированного с такой флуорофора тускнеет , когда он доки на SBL (рисунок 7, предст Результаты ив). Как слитый отверстие открывается и соединяет джипа и SBL мембран, флуоресцентные зонды диффундировать в SBL и стать более вероятно, будут возбуждаться S-поляризованный затухающих поле ^25,27,29. Следовательно, сигнал флуоресценции интегрированы вокруг зоны сварки резко возрастает во время переноса красителя из джипа в SBL ²⁷ (рисунок 3 и рисунок 7). Дополнительным фактором, который вносит свой вклад в сигнал изменения, которые сопровождают слияние dequenching флуоресцентных меток, поскольку они разбавляются при передаче в SBL. Вклад dequenching, как правило, незначительны по сравнению с исчезающим полем распада и поляризационных эффектов в анализе, описанном здесь, потому что лишь небольшая часть ( ) Липидов, помечены.

Увеличение сигнала при слиянии могут быть использованы вывести свойства поры слияния путем сравнения времени,1 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg "/>, необходимое для липидный бежать через поры, которая свободно проницаема для липидов к фактическому времени выпуска, , Если два шкалы времени сопоставимы, было бы сделать вывод о том, что пора представляет небольшое сопротивление потоку липидов. Тем не менее, если фактическое время высвобождения значительно больше, чем время для диффузионного ограниченного выпуска, это будет указывать на процесс, такие как поры мерцанием, замедляющие высвобождение липидов. Диффузии ограниченного времени выпуска, , Зависит от размера плавящимся липосом и липидный-диффузивности; его оценка требует эти два параметра должны быть определены количественно. Одна молекула чувствительность анализа позволяет липидный коэффициент диффузии измеряется путем отслеживания нескольких одного липидные флуорофоры после их высвобождения в SBL для каждого слитого события ^26. Размер каждого сплавленных везикулыможно оценить ²⁷ путем объединения (I) интенсивность одного липидного красителя (II) изменение общей флуоресценции вокруг док – сайта после того, как все флуорофоры переносятся в SBL при слиянии, (III) известной плотности маркировки внедорожника липиды, и (IV), область на липида. Для многих слитых событий, были найдены фактическое время высвобождения липидов, гораздо медленнее , чем ожидалось диффузионной-регулируемого высвобождения ^27, как было отмечено ранее в предположении унифицированный размер SUV ^44. Предполагая , что замедление высвобождения липидов из – за пор мерцает, количественная модель позволяет оценить "открытость пор", доля времени пор остается открытым во время плавления ^27.

Всякий раз, когда практические, важно проверить механизмы слитые с использованием как липидный и растворимые содержимое этикетки. Например, высвобождение липидов может быть тормозится отличных пор мерцанием процессов, таких как ограничение диффузии липидов с помощью силки белков, которые окружают тон пор. Если бы это было так, то выброс содержимого будет предшествовать выпуск липидных меток, при условии, что поры достаточно большой, чтобы позволить прохождение растворимых зондов. Более фундаментальный недостаток в подходе может быть в предположении, что передача меченых липидов в SBL происходит через узкий поры слияния, соединяющей SBL с пузырьком, который в значительной степени сохранил свой предварительно слитый форму. Перенос липидов в SBL может также быть результатом быстрого дилятацией поры слияния с сопутствующим, чрезвычайно быстрым распадом SUV в мембрану SBL, как и предполагалось ранее на основе данных высвобождения липидного только ^29. Мониторинг жиро- и содержание выпустить одновременно, было обнаружено , что многие поры закупорить после освобождения всех их липидного метки, но сохранил некоторые из их растворимой груза ^27. Это указывает на то, что по крайней мере некоторые липосомы не разрушаются в SBL после слияния, и что передача липидная красителя в SBL происходит через поры слияния. Кроме того, лIPID и содержание релиз произошло одновременно ^27, что делает его маловероятным , что замедление высвобождения липидов было связано с затруднением диффузии липидов с помощью SNARE белков , окружающих поры ^45.

Протокол слияния SUV-SBL , который не контролировать содержание растворимых релиз ранее опубликованных Karatekin и Ротман ^25. Здесь более недавние события включены, а именно одновременный мониторинг липидов и содержание релиз и оценка SUV, липидных и слитый пор свойства ^27. Протокол начинается с инструкции по подготовке Микрожидкостных клетки, изготовленные путем соединения поли (диметил силоксан) (PDMS) эластомер блок , содержащий канавки с покровным стеклом ^25. Далее, подготовка V-внедорожников с обоими липида и содержание маркеров объясняется. Разделы 4 и 5 содержат инструкции по сборке Микрожидкостных клеток, образуя SBLs на месте и проверки на наличие дефектов и текучестью, введение VŠUVS в клетки потока и обнаружение слитых событий. Раздел 6 содержит инструкции для анализа данных.