SNARE-vermittelte Fusion von Einzelproteoliposomen mit Tethered Unterstützte Bilayers in einer Zelle Mikrofluidik-Flow-Überwacht durch polarisierte TIRF Mikroskopie

Die Membranfusion ist ein universeller biologischer Prozess , die für intrazellulären Transport von Lipiden und Proteinen, Sekretion, Befruchtung, Entwicklung und umhüllte Virus den Eintritt in die Wirtsorganismen ^1-3. Für die meisten intrazellulären Fusionsreaktionen einschließlich der Freisetzung von Hormonen und Neurotransmittern über Exozytose, die Energie zwei Lipid – Doppelschichten zu verschmelzen wird durch die Bildung eines Vier-Helix – Bündel von cognaten löslichen N-Ethylmaleimid-sensitive Faktor Attachment – Protein – Rezeptor (SNARE) Proteine ​​zur Verfügung gestellt, verankert in das Vesikel (v-SNARE) und die Zielmembran (t-SNARE) ^4. Synaptischen Vesikel Exocytose ist die streng reguliert Fusionsreaktion und tritt innerhalb einer Millisekunde nach der Ankunft eines Aktionspotentials ^1,4,5. Die Fusionspore, die erste Verbindung zwischen den beiden Verschmelzen Fächer, flackern offen und geschlossen mehrere Male vor der Wiederverschließung oder irreversibel ^5-7 erweitert. Die bisherigen Ergebnissein transient, "Kiss & run" Fusion, während Letzteres führt zur vollständigen Fusion. Faktoren , die die Balance zwischen diesen beiden Modi der Fusion regeln und Mechanismen Poren Flimmern Regulierung sind nicht gut ^5,8 verstanden.

SNARE-Proteine ​​sind für die Exocytose erforderlich; synaptischen Vesikel Fusion ⁹ , bei der Spaltung von SNARE durch Neurotoxine abgeschafft. Bulk – Fusionsexperimente mit kleinen unilamellaren Vesikeln (SUVs) haben gezeigt , dass SNAREs sind nicht nur erforderlich, sondern auch eine ausreichende Membranfusion ¹⁰ zu fahren. In diesem bulk Assay mit v-SNARE rekonstituiert SUVs (v-SUV) wurden mit fluoreszierenden Phospholipide (N dotiertem – (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) -phosphoethanolamine (NBD-PE) und ( N -. (Lissamins Rhodamin B sulfonyl) -phosphoethanolamine (LR-PE) und gemischt mit nicht – markierten Vesikeln t-SNAREs (t-SUV) Zunächst wird die Fluoreszenz von NBD-PE in v-SUVs wird abgeschreckt durch Förster – Resonanzenergietransfer (FRET enthaltend ) zu LR-PE. Da LaborELED v-SUVs Sicherung mit unmarkiertem t-SUVs, das Fluorophor Oberflächendichte in der nun kombinierten Membran reduziert wird und die sich ergebende Erhöhung der NBD-PE – Fluoreszenz berichtet , um das Ausmaß der Lipid – ¹⁰ gemischt wird . Da der Groß Assay einfach einzurichten und zu analysieren ist, wurde es allgemein zu untersuchen Mechanismen der SNARE-vermittelte Fusion ^10-14 verwendet. Allerdings hat es einige Einschränkungen, wie niedrige Empfindlichkeit und schlechte Zeitauflösung. Am wichtigsten ist, als Ensemble-Messung, mittelt Ergebnisse aller Ereignisse zwischen docking und Fusion sowie Detektion von hemifusion Zwischenprodukte erschwert Diskriminierung.

In den letzten zehn Jahren mehrere Gruppen, darunter auch unsere, haben neue Assays entwickelt , um Fusionsereignisse an der einzelnen Vesikel Ebene ^15-27 überwachen. Ha und Kollegen verwendeten V-SUVs auf eine Oberfläche gebunden und überwacht ihre Fusion mit kostenlosen T-SUVs ^18,19. Lipidmischung wurde unter Verwendung von FRET zwischen einem Paar von Lipid-gebundenen Fluorophoren überwacht emin der v- und T-SUVs bett jeweils ¹⁸ Totalreflexions – Fluoreszenz (TIRF) Mikroskopie. Später benutzte Brunger Labor eine einzige Lipid-Label – Spezies zusammen mit einem Inhalt Marker für die simultane Detektion von Lipid und Inhalt ^20,28 mischen. Sowohl das Lipid und die Inhalte Marker wurden bei hohen, selbstlöschenden Konzentrationen enthalten sind; Fusion mit unmarkierten SUVs führte Fluoreszenz Dequenching ^20,28.

Andere haben fusioniert v-SUVs auf planaren Doppel Rekonstitution mit t-SNAREs ^{15-17,21-27,29.} Die planare Geometrie des Targets (t-SNARE enthält) bilayer besser imitiert die physiologische Fusionsprozess von kleinen, stark gekrümmten Vesikel mit einer flachen Plasmamembran. Die Steinem Gruppe poren Spanning Membranen rekonstituiert mit t-SNAREs, suspendiert über ein poröses Siliciumnitridsubstrats und detektiert Fusion mit einzelnen V-SUVs mit der konfokalen Laser – Scanning – Mikroskopie ²³ eingesetzt. Andere fgebrauchte v-SUVs zu planar bilayers mit t-SNAREs rekonstituiert, auf einem Glassubstrat ^{15-17,21,22,24-27,29} unterstützt. Der große Vorteil bei der Verwendung unterstützt Bilayer (SBLS) ist, dass die TIRF-Mikroskopie verwendet werden können, Docking und Fusionsereignisse mit hervorragenden Signal-Rausch-Verhältnis und ohne Interferenz von freiem V-SUVs zu erkennen, obwohl auch Einzelereignis Mikrofluidik mit Auflösung bietet mit Standard Fernfeld – Epifluoreszenzmikroskopie ^24.

Ein wichtiges Anliegen ist, ob und wie Substrat-Wechselwirkungen Bilayer Bilayer Qualität und den Fusionsprozess unterstützt Affekt. Frühe Arbeiten gemacht Verwendung von planaren SBLS , die auf einem Glas- oder Quarzsubstrat ^15-17 direkt unterstützt wurden. Diese SBLS wurden durch Adsorption hergestellt, bersten, Aufstreichen und Fusion von T-SUV Membranen auf dem Substrat. Es wurde jedoch bald erkannt, dass ein Schlüssel t-SNARE-Komponente weggelassen, SNAP25 aus SBLS auf diese Weise hergestellten führte V-SUV Andocken und Fusion Kinetik indistinguisHable von denen ¹⁷ mit der kompletten t-SNAREs erhalten. Da SNAP25 absolut für die Fusion in vivo ^30,31 erforderlich ist, wurde die physiologische Relevanz dieser frühen Versuche in Frage gestellt. Tamm Gruppe überwanden diese Herausforderung durch eine bessere Verwendung von ²¹ unterstützten Doppelschichtbildung gesteuert. Es verwendete Langmuir-Blodgett – Abscheidung für die proteinfreie erste Beilage des SBL, gefolgt von der Fusion von dieser Monoschicht mit t-SUVs ^21. Dies resultierte in SNAP25 abhängigen Fusion.

Potentielle Artefakte mit einer Doppelschicht direkt unterstützt auf einem Glassubstrat ohne die Notwendigkeit zu verwenden , Langmuir-Blodgett – Verfahren, zu vermeiden, Karatekin et al. Eingeführt einem weichen, hydratisierten Poly (ethylenglycol) (PEG) Polsters zwischen der Doppelschicht und dem Substrat ^24. Diese Änderung führte auch in SNAP25 abhängigen Fusion ^24. Doppelschichten auf einer Schicht weichen Polymer abgefedert war bekannt Trans besser zu bewahrenProtein Mobilität und Funktion ^32, und hatte in der Fusionsstudien mit Viren ³³ verwendet. Zusätzlich PEGylierten bilayers scheinen gewisse Fähigkeit zur Selbstheilung und sind sehr robust ^34,35 zu halten. Zunächst wird eine Fraktion des handelsüblichen, Lipid-gebundenen PEG-Ketten sind in der t-SUV-Membran enthalten. Wenn diese t-SUVs bersten und eine planare Doppelschicht auf einem Glassubstrat bildet, erstreckt sich ein PEG brush beide Blättchen der planaren Bilayer. Weil planaren Doppelschichtbildung durch Anhaften der PEG-Ketten umgebenden t-SUVs auf die hydrophile Glasoberfläche, Liposom Berst- und planaren Doppelschichtbildung sind relativ unempfindlich gegenüber der Lipidzusammensetzung eingesetzt angetrieben wird. Wenn jedoch große Mengen an Cholesterin enthalten sind, die Kohäsionseigenschaften der SUVs zu erhöhen, können die SUVs nicht spontan platzen. Wenn dies der Fall ist, kann osmotischen Schock oder zweiwertige Ionen eingesetzt werden ²⁵ planar Doppelschichtbildung zu helfen.

Wie oben erwähnt, in diesem apsatz eine PEG-Bürste auf beiden Seiten des ebenen umfasst, supported bilayer. Die Bürste den mikrofluidischen Strömungskanal zugewandt hilft unspezifischen Adhäsion von eingehenden v-SUVs zu verhindern, die sich auch in der Regel mit einer PEG-Schicht bedeckt. Die Bildung von v- und T-SNARE – Komplexen geht von der Membran-distalen N-Termini und verläuft in Stufen in Richtung der Membran-proximalen Domänen ^36. Für die V-SUVs mit dem t-SBL, die v- und t-SNARE N-Termini Notwendigkeit vorzustehen über den PEG Bürsten zu interagieren, was der Fall unter den Bedingungen des Assays zu sein scheint. Bürstenhöhe können an andere Proteine ​​als SNAREs studieren angepasst werden , indem die Dichte von PEGyliertem Lipiden variierende und die PEG – Kettenlänge ^37,38. Ein weiterer Vorteil der PEG – Bürsten die proximalen Oberflächen der Fusionieren Bilayer bedeckt , ist , dass sie die überfüllten Umgebung von biologischen Membranen imitieren , die mit 30.000-40.000 integrale Membranproteine ​​pro Quadratmikrometer ³⁹ verpackt werden. Genau wie die PEG-Ketten in diesem Assay die repulsive Proteinschicht, die biologischen Membranen muss gedrückt werden, zur Seite für den Kontakt zwischen den beiden Phospholipiddoppelschichten zu ermöglichen für die Fusion auftritt.

Mikrofluidischen Strömungskanäle werden in diesem Test verwendet, da sie einzigartige Vorteile bieten. Erstens ermöglicht mikrofluidischen Strömungs einheitlichere Abscheidung von T-SUVs zu verbreiten und Sicherung der t-SBL zu bilden. Zweitens ist die kleine Kanalvolumen (<1 & mgr; l) minimiert Probenverbrauch. Drittens benötigt die kleinen Volumina ermöglichen das gesamte Experiment unter konstanten Fluss durchgeführt werden. Fluss entfernt schwach, vermutlich nicht spezifisch haftete v-SUVs von der SBL ^16. Es unterhält auch eine konstante Dichte von v-SUVs über dem t-SBL, kinetische Analyse zu vereinfachen ^17. Schließlich werden dockt Vesikel aus kostenlos sind durch die Strömung ²⁵ durch leicht zu unterscheiden. Viertens mehrere mikrofluidische Kanäle auf dem gleichen Deckglas verwendet werden, die jeweils einen anderen Zustand Sondieren. Dies ermöglicht den Vergleich der Bedingungen during der gleichen Versuchslauf. Ein ähnlicher Ansatz wurde von der van Oijen Gruppe verwendet Fusion zwischen Influenza – Virus zu studieren und gepolsterten SBLS ^33.

In TIRF Mikroskopie, das exponentielle Abklingen des evaneszenten Feldes (mit einer Zerfallskonstante ~ 100 nm) Fluoreszenzanregung beschränkt auf diejenigen Moleküle, die in unmittelbarer Nähe der Glaspufferschnittstelle sind. Dies minimiert Beitrag von fluoreszierenden Molekülen, die weiter entfernt sind, erhöht das Signal-zu-Rauschverhältnis und erlaubt Einzelmolekülempfindlichkeit mit Rahmen Belichtungszeiten von 10-40 msec. Das abklingende Feld führt auch zu einem Signalanstieg beim Schmelzen: als markierter Lipide Transfer vom SUV in die SBL, finden sie sich im Durchschnitt in einer stärkeren Erregungsfeld. Dieser Anstieg in der Fluoreszenz ist für größere Liposomen stärker.

Wenn polarisiertes Licht verwendet wird, das abklingende Feld zu erzeugen, tragen zusätzliche Effekte zu Veränderungen in der Fluoreszenz auf transfer von Etiketten aus dem SUV in die SBL. Einige Lipid-Farbstoffe haben einen Übergangsdipolmomente orientiert mit einem bevorzugten mittleren Winkel in Bezug auf die Doppelschicht in die sie eingebettet sind. Dies erzeugt eine Differenz in der Menge an Fluoreszenz , die durch die Fluorophore emittiert wird, wenn sie in der gegenüber dem SUV SBL sind, da die polarisierten Strahl Farbstoffe in den beiden Membranen unterschiedlich erregt wird. Für erstere wird der Anregungsstrahl mit Übergangsdipole interagieren um den sphärischen SUV orientiert, während für letztere Dipolorientierungen wird durch die flache SBL Geometrie beschränkt werden. Wenn beispielsweise s-polarisierte einfallende Licht (polarisiertes normal zur Einfallsebene) verwendet wird, ist Erregungs effizienter , wenn der Farbstoff in der SBL ist als im SUV für eine Lipidfarbstoff Übergangsdipolmomente parallel zu der Membran ^29,40 (wie die von Dil oder DiD ^41-43). Ein SUV mit einem solchen Fluorophor dotierten erscheint dunkler , wenn es Docks auf die SBL (Bild 7, Representat ive Ergebnisse). Als Fusions Pore öffnet und verbindet die SUV und SBL Membranen diffundieren Fluoreszenzsonden in das SBL und werden eher durch den s-polarisierten abklingende Feld ^25,27,29 angeregt werden. Folglich erhöht sich das Fluoreszenzsignal um die Fusionsstelle integriert scharf während der Farbstoffübertragung von dem SUV in die SBL ²⁷ (Abbildung 3 und Abbildung 7). Ein zusätzlicher Faktor, der auf Signaländerungen trägt, die Fusions begleiten wird Dequenching von Fluoreszenzmarkierungen, wie sie verdünnt werden, wenn sie in die SBL übertragen. Der Beitrag der Dequenching ist üblicherweise gering im Vergleich zu abklingende Feld Zerfalls und Polarisationseffekte in dem Assay hier beschrieben, da nur ein kleiner Bruchteil ( ) Der Lipide sind markiert.

Der Signalanstieg bei Fusion kann ausgenutzt werden, um Fusionsporeneigenschaften ableiten, indem sie die Zeit zu vergleichen,1 "src =" / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg "/>, die für ein Lipid durch eine Pore zu entkommen, die frei durchlässig Lipide auf die tatsächliche Release-Zeit ist, . Wenn die beiden Zeitskalen vergleichbar sind, würde geschlossen werden, daß die Poren wenig Widerstand gegen Lipidfluss darstellt. Wenn jedoch die tatsächliche Auslösezeit wesentlich länger als die Zeit für die Diffusion begrenzte Freisetzung ist, wäre dies ein Verfahren zeigen, wie Poren Flackern, Lipid-Freisetzung zu verzögern. Die diffusionsbegrenzten Freigabezeit, , Hängt von der Größe des Schmelz Liposom und Lipid-Diffusionsvermögen; seine Schätzung erfordert diese beiden Parameter zu quantifizieren. Die Einzelmolekülempfindlichkeit des Assays ermöglicht Lipid Diffusität durch die Verfolgung mehrerer Einzellipid Fluorophore nach ihrer Freisetzung in die SBL für jedes Fusionsereignis ²⁶ gemessen werden. Die Größe jedes Verschmelzen Vesikel²⁷ durch die Kombination von (i) geschätzt werden , um die Intensität eines einzelnen Lipid Farbstoff kann, (ii) die Änderung der Gesamtfluoreszenz um eine Andockstelle nachdem alle Fluorophore in die SBL beim Schmelzen übertragen werden, (iii) die bekannte Markierungsdichte von SUV Lipide, und (iv) die Fläche pro Lipid. Für viele Fusionsereignisse wurden die tatsächlichen Lipid Freisetzungszeiten gefunden viel langsamer als ²⁷ durch diffusionskontrollierte Freisetzung erwartet, wie zuvor einheitliche Größe SUV ⁴⁴ unter der Annahme festgestellt wurde. Unter der Annahme , Verzögerung der Lipid – Freisetzung durch flackert Poren, ein quantitatives Modell ermöglicht Schätzung von "Poren Offenheit", der Anteil der Zeit bleibt die Pore offen bei der Fusion ^27.

Wann immer praktisch, ist es wichtig, Fusionsmechanismen zu testen, unter Verwendung von sowohl Lipid und löslichen Inhalt Etiketten. Zum Beispiel könnte Lipid-Freisetzung durch andere Prozesse als die Poren Flackern, wie die Beschränkung der Lipid-Diffusion durch die SNARE-Proteine, die Surround-t verzögert werdener Pore. Wenn dies der Fall wäre, dann loslassen Inhalts würde Freisetzung von Lipid Etiketten voran, vorausgesetzt die Poren groß genug ist, Durchgang von löslichen Sonden zu ermöglichen. Ein grundlegender Fehler im Ansatz könnte in der Annahme sein, dass die Übertragung von markierten Lipide an die SBL einer engen Fusionspore erfolgt durch die SBL zu einem Vesikel anschließen, der seine Pre-fusion Form weitgehend erhalten hat. Lipid – Transfer in die SBL könnte auch mit einer begleitenden von einer schnellen Erweiterung der Fusionspore führen, extrem schnellen Zusammenbruch des SUV in die SBL – Membran, wie zuvor auf den Lipidfreisetzungsdaten allein ²⁹ basierend vorschlug. Überwachung sowohl Lipid und Inhalt freigeben gleichzeitig wurde festgestellt , dass viele Poren wieder verschlossen , nachdem alle Etiketten ihre Lipid zu veröffentlichen, aber ²⁷ einige ihrer löslichen Ladung erhalten. Dies zeigt, dass zumindest einige Liposomen in die SBL nicht nach dem Verschmelzen kollabieren, und daß die Lipidfarbstoffübertragung in die SBL Fusions Pore erfolgt durch. Zudem lIPID und Inhalt Release aufgetreten ²⁷ gleichzeitig, ist es unwahrscheinlich , dass Verzögerung der Lipid – Release machen zurückzuführen war durch die SNARE – Proteine ​​von Lipiddiffusion Behinderung ⁴⁵ der Pore umgibt.

Ein SUV-SBL Fusionsprotokoll , die nicht löslichen Anteile Release überwachen tat , war zuvor von Karatekin und Rothman ²⁵ veröffentlicht. Hier neuere Entwicklungen enthalten sind, nämlich die gleichzeitige Überwachung von Lipid und Inhalte freigeben und die Schätzung von SUV, Lipid und Fusionspore – Eigenschaften ^27. Das Protokoll beginnt mit Anweisungen für die Mikrofluidik – Zellen vorbereitet, hergestellt durch ein Poly (dimethylsiloxan) Bindung (PDMS) Elastomerblock enthält Rillen mit einem Deckglas ^25. Als nächstes Herstellung von v-SUVs mit sowohl Lipid und Inhalt Marker erläutert. Abschnitte 4 und 5 enthalten Anweisungen für die Mikrofluidik – Zellen zusammenbauen, die SBLS in situ Bildung und Überprüfung auf Defekte und Flüssigkeit, die Einführung von vSUVS in den Flusszellen und die Detektion von Fusionsereignissen. Abschnitt 6 enthält Anweisungen für die Datenanalyse.