Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Angeborene Immunzellen bilden einen wesentlichen Teil der Zellen innerhalb der Tumor – Mikroumgebung und wurden mit Tumor Malignität in Patienten und Tiermodellen von Krebs ¹ verbunden. Vor kurzem hat es sehr geschätzt werden , dass eine chronische Immunreaktionen eine entscheidende Rolle bei der Förderung der Tumorprogression, Metastasierung und Resistenz gegen Chemotherapien ² spielen. Makrophagen sind wichtige angeborenen Immunzellen , die direkt gezeigt worden ist, um Tumorzellantwort auf Chemotherapie ^3,4 regulieren. Allerdings ist die Rolle der Neutrophilen, wichtige Akteure in der angeborenen Immunsystems, bei der Regulierung der Tumor Reaktion auf Anti-Krebs-Behandlung nicht bekannt. Die Ziele dieser Protokolle sind eine schnelle und glaubwürdige Methode zu verwenden Neutrophilen von CLL Patienten Blutproben zu trennen und HL60-Zellen entlang der granulocytic Weg, um ihre Rolle zu unterscheiden bei der Regulierung der Empfindlichkeit von Lymphomzellen zu Anti-Lymphom-Agenten zu studieren.

<p class= "jove_content"> Neutrophile sind die am häufigsten vorkommende zelluläre Komponente des angeborenen Immunsystems im Blut ⁵ und wirken als erste Verteidigungslinie gegen Mikroorganismen ⁶ eindringen. Neutrophile haben eine wesentliche Rolle ⁷ wirksam angeborenen Immunantwort zusätzlich zu den variablen Effektor – Funktionen in verschiedenen pathologischen Zuständen in steigenden. Daher ist eine schnelle und glaubwürdige Methode Neutrophile von anderen Blutzellen, wie Dichtegradient – Trennverfahren zu isolieren, ist für in vitro – Studien erforderlich. Unter Verwendung dieses Verfahrens zur Isolierung von Neutrophilen erleichtert die weitere Forschung auf Neutrophilen-vermittelten immunologischen Funktionen in vivo und ex vivo.

Die Fähigkeit , reine Populationen von Neutrophilen zu erhalten , ist ein wichtiger erster Schritt für die Untersuchung von Patienten mit immunologischen Erkrankungen ^8. Dichtegradienten-Trennungsverfahren ist ein ideales Verfahren, bei dem eine hohe Ausbeute an Zellen erhalten wird. Die method beinhaltet die Zugabe von Dichtegradient-Lösung in den Boden eines Röhrchens verdünnten Humanblut durch Zentrifugation für 35 min bei 300 g ohne Bruch enthält, gefolgt. Der Ring der einkernigen Zellen erscheint an der Schnittstelle und die Neutrophilen liegen unterhalb des ersteren. Diese Verfahren haben erhebliche Vorteile gegenüber anderen verfügbaren Verfahren, wie Neutrophilen – Isolierungs – Kits , die ⁹ viel teurer sind. Zusätzlich Neutrophilen aus menschlichem Blut durch kommerzielle Kits unter Verwendung von Antikörpern, die an einen Oberflächenmarker spezifisch für humane Neutrophile, erhöhen das Risiko von Zell-Aktivierung oder Differenzierung zu isolieren. Dichtegradienten Trennungsverfahren erlaubt die Isolierung von neutrophilen Granulozyten innerhalb eines kurzen Zeitraums. Innerhalb der gleichen Schritt werden mononukleäre Zellen ebenfalls abgetrennt und gewonnen. Es ist eine grundlegende Technik, bei dem eine hohe Ausbeute an reinen Zellen, um erhaltene funktionelle Integrität zu erzielen.

Um den Tumor microenv zu imitierenironment wurden 3D-Experimente durchgeführt. In Anbetracht der kurzen Halbwertszeit von Neutrophilen in vitro, sind die 3D – Experimente mit frischen menschlichen Neutrophilen nicht schlüssig. Dimethylsulfoxid (DMSO) und Retinsäure (RA) mit Hilfe der Differenzierungsinduktoren Aus diesem Grund promyelocytic (HL60-Zellen) induziert in Neutrophilen-ähnliche Zellen zu differenzieren. Mit differenzierten HL60 – Zellen (HL60 diff) wird verhindert , dass unterschiedliche Reaktionen von Neutrophilen, die aufgrund Isolierung von verschiedenen Spendern.

In – vitro – 3D – Kulturmodelle stellen eine Zwischenstufe zwischen In – vitro – 2D – Modelle und in vivo Modellen. Im 2D-Kultur, breiteten sich die Zellen auf Kunststoff-Oberfläche unnatürliche Zelle Anhänge abgeschiedenen Proteine ​​bilden, die auf dieser synthetischen Oberfläche denaturiert werden. Umgekehrt können die Zellen in 3D-Kulturform natürliche Zell-Zell-Anlagen, da die Zellen und die extrazelluläre Matrix synthetisieren sie das natürliche Material, an dem sie angebracht sind.Aus diesem Grund 3D Kokultur Modellen, insbesondere zwischen Krebszellen und anderen Zelltypen, ist der Beitrag zu Tumorwachstum, Angiogenese und Metastasierung sehr nützlich für die Anzeige. Als Ergebnis machen 3D – Kulturen die Zellkultur , die physiologischen Bedingungen nachahmen , die mit ¹⁰ in vivo existieren.