Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen
Summary
Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.
Abstract
Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils ≥ 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.
Introduction
Aangeboren immuuncellen een essentieel deel van de cellen in de tumor micro-omgeving en zijn geassocieerd met tumor maligniteit bij patiënten en diermodellen van kanker 1. Onlangs is het uitgegroeid tot meer alom gewaardeerd dat chronische immuunrespons spelen cruciale rol bij het bevorderen van progressie van de tumor, metastase en weerstand tegen chemokuren 2. Macrofagen zijn belangrijke aangeboren immuuncellen die zijn aangetoond om rechtstreeks de tumorcel respons op chemotherapie 3,4. Echter, de rol van neutrofielen, belangrijke spelers in het aangeboren immuunsysteem bij de regulering van tumor-respons op de behandeling tegen kanker niet bekend. Het doel van deze protocollen is een snelle en betrouwbare methode om neutrofielen uit bloedmonsters CLL patiënt scheiden en HL60 cellen differentiëren langs de granulocyten route om de rol te bestuderen in het reguleren van de gevoeligheid van de lymfoomcellen anti-lymfoom middelen.
<p class= "jove_content"> Neutrofielen zijn de meest voorkomende cellulaire component van het aangeboren immuunsysteem in het bloed 5 en fungeren als een eerste lijn van verdediging tegen binnendringende micro-organismen 6. Neutrofielen een essentiële rol bij stijgende aangeboren immuun responsen naast variabele effectorfuncties in verschillende pathologische aandoeningen 7. Daarom is een snelle en betrouwbare methode om neutrofielen van andere bloedcellen zoals dichtheidsgradiënt scheidingsmethode isoleren vereist voor in vitro studies. Deze methode voor neutrofielen isolatie verder onderzoek neutrofiel-gemedieerde immunologische functies in vivo en ex vivo vergemakkelijken.Het vermogen om zuivere populaties van neutrofielen te verkrijgen is een belangrijke eerste stap bij het onderzoek naar patiënten met immuunziekten 8. Dichtheidsgradiënt scheidingswerkwijze een ideale techniek waarbij een hoge opbrengst aan cellen is verkregen. de method bij de bereiding dichtheidsgradiënt oplossing in de bodem van een buis met verdunde humaan bloed gevolgd door centrifugatie bij 300 g gedurende 35 min zonder onderbreking. De ring van de mononucleaire cellen wordt in de interface en de neutrofielen bevinden onder het eerste. Deze werkwijze heeft grote voordelen ten opzichte van andere beschikbare werkwijzen zoals neutrofielen isolatie kits die veel duurder zijn 9. Bovendien isoleren neutrofielen uit menselijk bloed door commerciële kits behulp van antilichamen gericht op een oppervlak marker specifiek is voor humane neutrofielen, het risico van celactivering en differentiatie. Dichtheidsgradiënt scheidingswerkwijze maakt de isolatie van neutrofielen binnen een korte tijd. In dezelfde stap worden mononucleaire cellen ook afgescheiden en gewonnen. Het is een fundamentele techniek waarbij een hoge opbrengst aan zuivere cellen verkregen om functiebehoud bereiken.
Om de tumor nabootsen microenvironment, 3D experimenten uitgevoerd. Gezien de korte halfwaardetijd van neutrofielen in vitro, 3D experimenten met verse menselijke neutrofielen niet overtuigend. Daarom worden promyelocytische (HL60) cellen geïnduceerd om te differentiëren tot neutrofiel-achtige cellen met de differentiatie inducerende dimethylsulfoxide (DMSO) en retinoïnezuur (RA). Gebruik gedifferentieerde HL60 cellen (HL60 diff) voorkomt met verschillende responsen van neutrofielen door isolatie van verschillende donoren.
In vitro 3D cultuurmodellen vormen een tussenstap tussen in vitro 2D modellen en in vivo modellen. In 2D-cultuur, de cellen uitgespreid op plastic oppervlak vormen onnatuurlijk cel bijlagen bij afgezette eiwitten die gedenatureerd op deze synthetische ondergrond. Omgekeerd, de cellen in kweek 3D vorm natuurlijke cel- attachments omdat de cellen en de extracellulaire matrix ze synthetiseren zijn het natuurlijke materiaal waaraan zij gehecht.Daarom 3D co-cultuur modellen, met name tussen kankercellen en andere celtypes, zijn zeer nuttig voor het aanduiden van hun bijdrage aan tumorgroei, angiogenese en metastase is. Hierdoor 3D culturen maken de celkweek bootsen de fysiologische omstandigheden die bestaan in vivo 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreven een effectieve, eenvoudige, snelle en goedkope protocol voor de isolatie van neutrofielen uit humaan bloed met hoge zuiverheid via dichtheidsgradiënt centrifugatie benadering en in dezelfde stap mononucleaire cellen worden ook afgescheiden en gewonnen. De geïsoleerde celpopulaties zijn ≥90% zuiver.
Verscheidene werkwijzen zijn beschikbaar voor neutrofielen isolatie uit humaan bloed. Deze omvatten dergelijke wijze met behulp van discontinue gradiënten 11,12 of …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Institute National du Cancer (INCa-DGOS-4664).
Materials
| RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium) | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
| N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine) | Life technologies | 25030-024 | |
| Penicillin streptomycin (Pen Strep) | Life technologies | 15140-122 | |
| Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib) | CliniSciences | A3001 | |
| Vincristine | EG labo | ||
| BD Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Put at 4 oC overnight before the day of the experiment |
| Red cell lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Ficoll (Pancoll) | PAN Biotech | P04-60500 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Euromedex | S3014 | |
| Annexing V-FLOUS staining kit | Roche | 11 988 549 001 | |
| Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit | Cosmos Biomedical | CB361550-0000 | |
| LSRII flow cytometry | BD Biosciences | ||
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | ||
| Leica DMR-XA microscope | Leica Microsystems | ||
| Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter | Nexcelom Bioscience |
References
- Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, Inflammation, and Cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Di Carlo, E., et al. The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood. 97, 339-345 (2001).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).
- Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).
- Kelbaek, H. Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).
- Aynaud, M. -. M., et al. Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A. J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).
- Ziòłkowska, K., et al. Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip. Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).
- Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers. J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).
- Behnen, M., et al. Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1. J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).
- Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -. P. Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids. PloS One. 7, 44606 (2012).
- Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. , e50586 (2013).
- Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo. Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).
- Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D. Apoptosis of neutrophils. ActaHaematol. 111, 56-66 (2004).
- Dalton, W. T., et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3. Blood. 71, 242-247 (1988).
- Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).
- Mantovani, A. Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword. New J. Sci. , 271940 (2014).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).
- Shojaei, F., Ferrara, N. Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells. Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).
- Liang, J., et al. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).
- Teramukai, S., et al. Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03. Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).
- Zhu, Q., et al. The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression. Cell Death Dis. 5, 1295 (2014).
