Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Les cellules immunitaires innées constituent une partie essentielle des cellules dans le microenvironnement de la tumeur et ont été associés à une tumeur maligne chez les patients et les modèles animaux de cancer ^1. Récemment, il est devenu plus largement apprécié que les réponses immunitaires chroniques jouent un rôle crucial dans la promotion de la progression tumorale, les métastases et la résistance aux chimiothérapies ^2. Les macrophages sont des cellules immunitaires innées importantes qui ont été montrés pour réguler directement la réponse des cellules tumorales à la chimiothérapie ^3,4. Cependant, le rôle des neutrophiles, des acteurs clés dans le système immunitaire inné, dans la régulation de la réponse tumorale au traitement anti-cancéreux est inconnue. Les objectifs de ces protocoles sont d'utiliser une méthode rapide et crédible pour séparer les neutrophiles provenant des échantillons de sang CLL du patient et de différencier les cellules HL60 le long de la voie granulocytaire afin d'étudier leur rôle dans la régulation de la sensibilité des cellules de lymphome à des agents anti-lymphome.

<p class= "jove_content"> Les neutrophiles sont le composant cellulaire le plus abondant du système immunitaire inné dans le sang ⁵ et agir comme une première ligne de défense contre les micro – organismes envahisseurs ^6. Les neutrophiles ont un rôle essentiel dans la hausse des réponses immunitaires innées efficaces en plus de fonctions effectrices variables dans plusieurs états pathologiques ^7. Par conséquent, un procédé rapide et fiable pour isoler neutrophiles à partir d' autres cellules sanguines, telles que la méthode de séparation par gradient de densité, est nécessaire pour des études in vitro. L' utilisation de cette méthode pour l' isolement des cellules neutrophiles facilitera de nouvelles recherches sur les fonctions immunologiques à médiation par les neutrophiles in vivo et ex vivo.

La capacité d'obtenir des populations pures de neutrophiles est une première étape importante pour l'étude des patients atteints de maladies immunologiques ^8. Densité procédé de séparation par gradient est une technique idéale dans laquelle un rendement élevé de cellules est obtenue. La méthod comprend l'ajout d'une solution à gradient de densité dans le fond d'un tube contenant du sang humain dilué suivi par une centrifugation à 300 g pendant 35 min sans pause. L'anneau des cellules mononucléaires apparaît à l'interface et les neutrophiles réside en dessous de la première. Cette méthode possède des avantages significatifs par rapport aux autres méthodes disponibles tels que des kits d'isolement neutrophiles qui sont beaucoup plus chers ^9. En outre, l'isolement des neutrophiles du sang humain par des kits commerciaux utilisant des anticorps dirigés contre un marqueur de surface spécifique pour les neutrophiles humains, augmentent le risque d'une activation ou la différenciation cellulaire. Densité procédé de séparation par gradient permet l'isolement des neutrophiles dans un court laps de temps. Dans le même temps, les cellules mononucléaires sont également séparés et récupérés. C'est une technique fondamentale dans laquelle un rendement élevé de cellules pur est obtenu afin d'obtenir l'intégrité fonctionnelle.

Afin d'imiter le microenv tumoralironnement, des expériences 3D ont été réalisées. Compte tenu de la courte demi-vie des neutrophiles in vitro, les expériences en 3D avec des neutrophiles humains fraîches ne sont pas concluants. Pour cette raison, promyélocytaire (HL60), les cellules sont amenées à se différencier en cellules neutrophiles-like en utilisant les inducteurs de différenciation diméthylsulfoxyde (DMSO) et de l'acide rétinoïque (RA). En utilisant des cellules HL60 différenciées (HL60 diff) permettra d' éviter d' avoir des réponses différentes de neutrophiles en raison de l' isolement de différents donateurs.

En 3D vitro des modèles de culture représentent une étape intermédiaire entre les modèles 2D in vitro et dans des modèles in vivo. Dans la culture 2D, les cellules réparties sur une surface plastique formant des pièces jointes de cellules anormales aux protéines déposées qui sont dénaturées sur cette surface synthétique. A l'inverse, les cellules en forme de culture 3D cellule-cellule naturelle jointes depuis les cellules et la matrice extracellulaire sont elles synthétisent le matériau naturel auquel ils sont attachés.Pour cette raison, les modèles de co-culture en 3D, en particulier entre les cellules cancéreuses et d'autres types de cellules, ont été très utiles pour indiquer leur contribution à la croissance tumorale, l'angiogenèse et les métastases. Par conséquent, les cultures 3D rendent la culture cellulaire miment les conditions physiologiques qui existent in vivo ^10.