عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية
Summary
Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.
Abstract
Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils ≥ 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.
Introduction
تشكل الخلايا المناعية الفطرية نسبة أساسية من الخلايا داخل المكروية الورم وارتبطت مع خباثة الورم في المرضى والنماذج الحيوانية من السرطان 1. في الآونة الأخيرة، فقد أصبح موضع تقدير على نطاق واسع أن الاستجابات المناعية المزمنة تلعب أدوارا حاسمة في تعزيز تطور الورم، ورم خبيث ومقاومة الكيميائي 2. الضامة هي خلايا المناعة الفطرية الهامة التي ثبت لتنظيم مباشرة استجابة الخلايا السرطانية للعلاج الكيميائي 3،4. ومع ذلك، لا يعرف دور العدلات، اللاعبين الرئيسيين في نظام المناعة الفطري، في تنظيم استجابة الورم للعلاج مضاد للسرطان. أهداف هذه البروتوكولات هي استخدام طريقة سريعة وموثوق بها لفصل العدلات من عينات الدم CLL المريض وللتمييز خلايا HL60 على طول الطريق المحببات لدراسة دورها في تنظيم حساسية خلايا سرطان الغدد الليمفاوية إلى وكلاء المضادة للسرطان الغدد الليمفاوية.
<p class= "jove_content"> العدلات هي العنصر الخلوي الأكثر وفرة من نظام المناعة الفطري في الدم 5 ويكون بمثابة خط الدفاع الأول ضد غزو الكائنات الحية الدقيقة 6. العدلات دورا أساسيا في ارتفاع الاستجابات المناعية الفطرية الفعالة بالإضافة إلى وظائف المستجيب المتغيرة في العديد من الحالات المرضية 7. لذلك، وهي طريقة سريعة وموثوق بها لعزل العدلات من خلايا الدم الأخرى، مثل طريقة الفصل التدرج الكثافة، مطلوب للدراسات في المختبر. وسوف تستخدم هذه الطريقة لعزل العدلات تسهيل إجراء مزيد من البحوث على وظائف مناعية بوساطة العدلات في الجسم الحي وخارج الحي.القدرة على الحصول على مجموعات نقية من العدلات هي خطوة أولى مهمة للتحقيق في المرضى الذين يعانون من الأمراض المناعية 8. كثافة طريقة فصل الانحدار هو أسلوب المثالية التي يتم الحصول على عائد مرتفع من الخلايا. وmethoد ينطوي على إضافة حل كثافة التدرج في الجزء السفلي من أنبوب يحتوي على الدم البشري المخفف تليها الطرد المركزي في 300 غ لمدة 35 دقيقة دون انقطاع. تظهر حلقة من الخلايا وحيدة النواة في واجهة والعدلات الموجودة أدناه السابق. هذه الطريقة لها مزايا كبيرة فيما يتعلق بأساليب الأخرى المتاحة مثل مجموعات العزلة المتعادلة التي هي أكثر تكلفة بكثير 9. وبالإضافة إلى ذلك، عزل العدلات من الدم البشري من قبل مجموعات تجارية باستخدام الأجسام المضادة الموجهة إلى علامة السطحية النوعية للعدلات الإنسان، تزيد من خطر تنشيط الخلايا أو تمييز. يسمح كثافة طريقة فصل التدرج عزل العدلات في غضون فترة قصيرة من الزمن. ضمن نفس الخطوة، وأيضا فصل الخلايا وحيدات النوى واستردادها. إنها تقنية الأساسية التي يتم الحصول على عائد مرتفع من خلايا نقية من أجل تحقيق السلامة الوظيفية.
من أجل تقليد microenv الورمironment، أجريت تجارب 3D. ونظرا لنصف عمر قصير العدلات في المختبر، والتجارب 3D مع العدلات الإنسان العذبة ليست نهائية. لهذا السبب، وبفعل البرولمفوسيت (HL60) الخلايا على التمايز إلى خلايا تشبه الخلايا المتعادلة باستخدام محرضات تمايز سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]) وحمض الريتينويك (RA). وذلك باستخدام خلايا HL60 متباينة (HL60 فرق) منع وجود استجابات مختلفة من العدلات بسبب العزلة من مختلف الجهات المانحة.
في 3D المختبر تمثل نماذج ثقافة مرحلة وسيطة بين في المختبر نماذج 2D و في النماذج الحية. في ثقافة 2D، والخلايا المنتشرة على سطح البلاستيك تشكيل إرفاق ملفات خلية غير طبيعية للبروتينات المودعة التي التشويه والتحريف على هذا السطح الاصطناعية. على العكس من ذلك، فإن الخلايا في شكل ثقافة 3D إرفاق ملفات الطبيعية خلية خلية منذ الخلايا والمصفوفة خارج الخلية التي توليف هي المواد الطبيعية التي ترد فيها.لهذا السبب، ونماذج 3D شارك في ثقافة، خصوصا بين الخلايا السرطانية وأنواع الخلايا الأخرى، كانت مفيدة جدا للإشارة إلى مساهمتها في نمو الورم، الأوعية الدموية، والانبثاث. ونتيجة لذلك، والثقافات 3D جعل ثقافة خلية محاكاة الظروف الفسيولوجية التي توجد في الجسم الحي 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
الموصوفة هنا، بروتوكول فعالة وبسيطة وسريعة وغير مكلفة لعزل العدلات من الدم البشري مع نقاء عالية باستخدام نهج الطرد المركزي التدرج الكثافة والواقعة في نفس الخلايا وحيدة النواة خطوة فهي أيضا مفصولة واستردادها. السكان خلية معزولة و≥90٪ نقية.
<p class="jove_content" style=";text-align:r…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Institute National du Cancer (INCa-DGOS-4664).
Materials
| RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium) | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
| N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine) | Life technologies | 25030-024 | |
| Penicillin streptomycin (Pen Strep) | Life technologies | 15140-122 | |
| Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib) | CliniSciences | A3001 | |
| Vincristine | EG labo | ||
| BD Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Put at 4 oC overnight before the day of the experiment |
| Red cell lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Ficoll (Pancoll) | PAN Biotech | P04-60500 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Euromedex | S3014 | |
| Annexing V-FLOUS staining kit | Roche | 11 988 549 001 | |
| Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit | Cosmos Biomedical | CB361550-0000 | |
| LSRII flow cytometry | BD Biosciences | ||
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | ||
| Leica DMR-XA microscope | Leica Microsystems | ||
| Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter | Nexcelom Bioscience |
References
- Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, Inflammation, and Cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Di Carlo, E., et al. The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood. 97, 339-345 (2001).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).
- Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).
- Kelbaek, H. Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).
- Aynaud, M. -. M., et al. Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A. J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).
- Ziòłkowska, K., et al. Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip. Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).
- Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers. J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).
- Behnen, M., et al. Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1. J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).
- Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -. P. Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids. PloS One. 7, 44606 (2012).
- Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. , e50586 (2013).
- Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo. Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).
- Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D. Apoptosis of neutrophils. ActaHaematol. 111, 56-66 (2004).
- Dalton, W. T., et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3. Blood. 71, 242-247 (1988).
- Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).
- Mantovani, A. Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword. New J. Sci. , 271940 (2014).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).
- Shojaei, F., Ferrara, N. Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells. Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).
- Liang, J., et al. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).
- Teramukai, S., et al. Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03. Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).
- Zhu, Q., et al. The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression. Cell Death Dis. 5, 1295 (2014).
