Summary

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Published: April 18, 2016
doi:

Summary

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Abstract

Dendritik hücreler (DC), elde etme işlemi ve T-hücresi-aracılı bağışıklık başlatma molekülleri antijen antijenler sunmak için başta sorumlu profesyonel antijen sunan hücrelerdir. Dendritik hücreler çeşitli fenotipik ve fonksiyonel heterojen alt kümeleri ayrılabilir. Dalak dendritik hücrelerin üç önemli alt grupları, CD8α Pos ve CD8α Neg hücreleri plasmasitoid vardır. plazmasitoid DCler tip I interferon doğal üreticileri ve anti-viral T hücre bağışıklık için önemlidir. CD8α Neg DC alt MHC sınıf II antijen sunumu için özel olan ve merkezi bir CD4 T hücrelerini priming yer almaktadır. CD8α Pos DH'ler eksojen antijenler ve CD8 T hücresi priming çapraz sunumu için öncelikle sorumludur. CD8α Pos DC'ler özel bir T cel için CD1d moleküller glycolipid antijenlerin sunumu en verimli olduğu ortaya konmuşturdeğişmeyen doğal öldürücü T (iNKT) hücreleri olarak bilinen l nüfus. FLT-3 ligand uygulanması sonuçta murin modellerinde periferal lemfoid organlarda, dendritik hücrelerin genişlemesi ile sonuçlanır kemik iliğinden dendritik hücre progenitörlerinin göç sıklığını artırmaktadır. Farklı DC alt gruplarının in vivo yeterliliğini karşılaştırma hücre transferi deneylerinde kullanılmak için fonksiyonel dendritik hücrelerin çok sayıda saflaştırmak için bu model adapte edilmiştir.

Introduction

"Büyük yıldızsı (Yunan dendron) hücre" lenfoid organlara 1 bulunduğu gibi dendritik hücreler (DC) neredeyse kırk yıl önce keşfedildi. Birçok çalışma, DH'ler etkili naif T hücreleri, 2 stimüle tek antijen sunan hücreler olduğunu göstermiştir. Bu hücrelerin önemli bir fonksiyonu, antijen molekülleri üzerine alımı ve antijenlerin sunumu ve verimli işlem ve bunların yüklenmesidir. fare dalağı içinde DH'ler plazmasitoid geleneksel alt-grup halinde ayrılabilir. plazmasitoid DH'ler CD11c düşük ekspresyon ve B220 ve GR-1'in yüksek düzeyleri ile karakterize edilir. Onlar da yüzey işaretleyici mPDCA1 için pozitif ve reseptör 9 (TLR9) ligandların gibi ücretli cevaben interferon türü salgılar. Geleneksel DH'ler CD11c ve MHC sınıf II ekspresyonu için yüksektir. Bunlar, CD4, CD8α, DEC205, CD fenotipik işaretleyiciler yüzey ekspresyonu göre üç farklı alt-grup halinde ayrılabilen11b ve (33D1 antikoru tarafından tanınan DCIR2) dendritik hücre inhibitör reseptör 2 proteinleri 3,4. CD8α Pos DH'ler da CDC1 olarak bilinir, bu tür CD11b ve 33D1 olarak miyeloid belirteçler için DEC205 için olumlu, ama olumsuzdur. Ayrıca Cdc2 denilen CD8α Neg DC'ler, 33D1, CD11b ve CD4 pozitif ama DEC205 yoksundur. Çift negatif alt kümesi (CD4 ve CD8α hem yani negatif) nadirdir ve DEC205 ve 33D1 için negatiftir. Bu en karakterize alt kümesi ve CD8α Neg DC daha az farklılaşmış formu olabilir.

Çeşitli DC alt gruplarında Fenotipik farklılıklar da in vivo fonksiyonları uzanır. CD8α Neg DH'ler yüksek fagositik ve esas olarak CD4 T hücrelerinin 3 MHC sınıf II ile ekzojen antijen mevcut olduğu düşünülmektedir. Bunun aksine, CD8α Pos DH'ler MHC sınıf I çözünür protein antijeni için özel olanbir mekanizma çapraz sunum denir. Çapraz sunum sonucu bu DCler 5 aktivasyon durumuna bağlıdır, ve sitotoksik T hücrelerinin (CTL'ler) veya düzenleyici T hücrelerinin 6 2,7 gelişimi genişlemesine neden olabilir ya da. Enfekte apoptotik hücrelerinden türetilen antijen sunumu kuvvetli bir CTL karşılığı 9 indükler ise, büyük ölçüde T-hücreleri, 8 silme anti-DEC205-antikor-aracılı teslim sonuçları kullanılarak CD8α Sıra DH'lere antijenin hedefleme.

Peptit antijenlerinin tanınması ek olarak, bir memeli bağışıklık sistemi lipid ve glikolipit antijenler tanımak gelişmiştir. Bu antijenler, çeşitli memelilerdeki çok benzer formlarda mevcut MHC sınıf I-benzeri hücre yüzeyi proteinleridir CD1 molekülleri tarafından sunulmaktadır. Farelerde, CD1d adlandırılan yüksek derecede korunmuş CD1 molekülünün tek tip glikolipit antijenler 10 sunumundan sorumludur. büyük CD1d / glikolipid kompleksleri tanıyan T hücre popülasyonu değişmeyen NKT hücreleri (iNKT hücre) adı verilir. Bu hücreler, çeşitlilik 11 sınırlı TCRβ zincirleri ile eşleştirilmiş bir değişmeyen TCRα zinciri oluşan bir yarı-değişmez T hücresi reseptörü (TCR) ifade etmektedir. Çoğalmak ve aktive efektör T hücreleri olmak için ayırt etmek gerekir geleneksel T hücrelerinin aksine, iNKT hücreleri efektör nüfus olarak var ve glikolipid idaresi 12 sonra hızla yanıt başlar. fizyolojik olarak uygun yağ antigen sunan hücrelerin tanımlanması, aktif bir araştırma alanıdır ve bu tip B hücreleri, makrofajlar ve DCler olarak birkaç farklı hücre tipleri bu işlemi gerçekleştirmek için önerilmiştir. Bununla birlikte, DC'lerin CD8α Pos grubu fare iNKT hücreleri 13 ve CD8 T hücreleri 14 glikolipid aracılı çapraz astarlama alımını ve lipid antijenlerin sunumu aracılık birincil hücre olduğu gösterilmiştir.

farklı antijen sunan hücreler tarafından antijen oluşumunun verimliliğini karşılaştırmak için,> "ove_content, basit bir yaklaşım, bu tür hücre transfer deneyleri genellikle immünolojik çalışmalar yapılmaktadır naif ana Antigenin eşdeğer miktarlarda ile doldurulan. saflaştınlmış APC 'lerin farklı transfer etmektir. bu hücreler, toplam hücrelerin 15% 2'sinden azını oluşturan lenfoid organlarda olduğu gibi nadir nüfusu var çünkü Ancak, ex vivo antijen tedavi DC'ler transfer çalışmalarını gerçekleştirirken, zordur. donör hayvanlarda bu hücrelerin gelişimini arttırmak için bu nedenle gereklidir izole etme protokolleri şu etkinliğini geliştirmek için.

Bilindiği gibi, PDC, CD8 Pos ve CD8 Neg DC alt kümeleri, ekspres fms bağlantılı reseptör tirosin kinaz 3 (Flt-3) oluşturulması için gerekli olan genel lenfoid ve ortak miyeloid progenitör. In vivo FLT-3 ligandı üzerine (Flt-3L) uygulama, emigratFlt-3, kemik iliği projenitör hücrelerin eksprese iyon periferal lemfoid organlarının artan tohum ve olgun DC döl 16 genişlemesi ile sonuçlanır artar. Flt-3 ifadesi B, T ve NK hücre farklılaşması yollara işlenmesi sırasında kaybolur. Bu nedenle, çok az değişiklikler Flt-3L uygulanması üzerine bu hücrelerde görülmektedir. DC popülasyonları benzer genişletme Flt-3L 17,18 sürekli sistemik düzeylerde temin edilmesi için basit ve ekonomik bir yöntem sağlar murin Flt-3L, salgılayan bir B16-melanom hücre hattı implantasyonu ile oluşturulan tümörleri taşıyan farelerde gözlenmiştir. Bu yaklaşımı kullanarak, bu şekilde büyük ölçüde daha sonraki deneyler için izole edilebilir, bu hücrelerin verimlerini büyük ölçüde artırmak, fare dalağı içinde normal DC alt-genişlemesini uyarmak için Flt-3L salgılayan B16 melanom hücreleri implantasyonundan göre bir protokol geliştirilmiştir . 14 gün deri altı im aşağıdaki – Biz sürekli 10 içinde bulmaktoplam dalak hücrelerinin% 60 – Flt-3 salgılayan tümör ekimi, fareler 40 oluşturacak DH'lerin belirgin zenginleşme ile splenomegali gelişebilir. Bu dalaklarından farklı DC alt-gruplar yüksek saflıkta Standard Bu alt-spesifik fenotipik işaretleyiciler kullanan ticari olarak temin edilebilen hücre saflaştırma kitleri kullanılarak izole edilebilir.

Protocol

Hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış esaslara uygun olarak yapılır. sterilite gerektiren tüm işlemler bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmaktadır. Farelerde B16.Flt3L Melanom 1. implantasyonu Kültür, 37 ° C'de% 10 CO2 ile birlikte DMEM ortamı içinde 0.5 x 10 6 hücre / ml'lik bir yoğunlukta T25 doku kültürü şişelerinde Flt-3 eksprese eden B16 melanoma hücre soyu. Hücre…

Representative Results

Bu prosedürün sonucu implante melanoma hücreleri tarafından ifade fare Flt-3L DC alt kümeleri genişletilmesi dayanmaktadır. B16.Flt3L tümör C57BL / 6 fareden türetildi ve red nedeniyle tesis haline tümörün başarısızlığı önlemek için bu suş kökenli, hayvanlara implante edilmiş olmalıdır. Bazı durumlarda, yollar veya ilgi reseptörleri sinyal bilinen kusurları ile DC'ler elde etmek için genetik olarak modifiye edilmiş fareler kullanmak arzu edilebilir. Tü…

Discussion

Dendritik hücrelerin T hücre yanıtlarının prime dahil sunan hücreler büyük profesyonel antijen olarak kabul edilmektedir. Onların ana fonksiyonu T hücrelerine sunum için antijenleri alarak ve işleyerek doku mikro incelemektir. Belirli DC alt gruplarının işlevini incelemek için, bu normal fenotip ve fonksiyonlarını koruyan bir yaklaşım kullanarak yeterli sayıda izole edilmesi gerekir. Çoğu protokolleri naif farelerin spesifik DC alt kümesi izolasyonu güveniyor. Bu hücreler az olduğu için, izol…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

çalışmalar AIDS Araştırma Einstein Kanser Merkezi'nde (NIH / NCI CA013330) ve Merkezi (NIH / NIAID AI51519) tarafından desteklenen FACS çekirdek imkanları kullanılarak gerçekleştirilmiştir sitometri Bu çalışma, SAP Flow NIH / NIAID hibe AI45889 tarafından desteklenmiştir.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA  Life Technologies, Gibco 25300-054
Isoflurane  Sigma-Aldrich CDS019936-250MG
Collagenase D  Roche Diagnostics 11088858001
DNase I (dry powder) QIAGEN 79254
200 proof ethanol  Thermo Fisher Scientific 9-6705-004-220 Used to prepare 70% ethanol
RBC lysis buffer Sigma-Aldrich R7757
RPMI-1640 medium with L-glutamine  Life Technologies, Gibco 11875-119
DMEM medium with L-glutamine  Life Technologies, Gibco 11995-073
200 mM L-glutamine  Life Technologies 25030081
MEM non-essential amino acids  Life Technologies, Gibco 11140-050
MEM essential amino acids  Life Technologies 11130-051 
β-mercaptoethanol  Life Technologies, Invitrogen 21985-023
Sodium pyruvate  Life Technologies 11360-070
HEPES  Life Technologies, Invitrogen 15630
Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) Life Technologies, Invitrogen 20012-050
Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) Life Technologies, Gibco 14040-182
0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution  Life Technologies 15575-020
Bovine serum albumin (BSA)  Sigma-Aldrich A2153
Fetal calf serum Atlanta Biologicals S11050 
Penicillin/streptomycin  Life Technologies, Invitrogen 15140-163
Trypan blue (dry powder)  Sigma-Aldrich T6146-5G  Prepare 0.08% with PBS
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse Miltenyi Biotech 130-092-786
Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c  Miltenyi Biotech 130-152-001
CD8αPos mouse DC isolation kit  Miltenyi Biotech 130-091-169
Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) BD Biosciences 553141
Anti-mouse CD11c-FITC  BD Biosciences 553801
Anti-mouse CD8α-PerCP  BD Biosciences 553036
Anti-mouse B220-PE  BD Biosciences 553090
1 ml syringes  BD 26048
23 G1 needle  BD 305145
100 mm Petri dishes  Thermo Fisher Scientific 875712
Surgical instruments  Kent Scientific INSMOUSEKIT
Cell strainer (70 µm  BD 352350
Large Petri plates  Thermo Fisher Scientific FB0875712
Vacuum filtration system (500 ml(0.22 um  Corning 431097
LS columns  Miltenyi 130-042-401
Magnetic stand MACS separator  Miltenyi Biotec 130-042-302
Wide-bore 200 μl pipette tips  PerkinElmer 111623
Corning ultra-low attachment 96-well plates  Corning CLS3474-24EA
6-8 week old female C57BL/6 mice  Jackson Research Laboratories, Jax
Murine B16.Flt3L melanoma cell line described by Mach et al. ,2000
Serum free DMEM and RPMI media
500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine

5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM)    

5 ml HEPES Buffer (1 M)    

5 ml L-glutamine (200 mM) 

0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need.  Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system.
Complete RPMI and DMEM media Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.
MACS buffer:  Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 ug/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). 
FACS staining buffer Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer
10x Collagenase D and DNase 1 stock solution
Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca++ and Mg++ to obtain a solution of approximately 1,000-
2,000 Units of collagenase activity per ml

This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use

References

  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  3. Dudziak, D., et al. Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo. Science. 315 (5808), 107-111 (2007).
  4. Belz, G. T., Nutt, S. L. Transcriptional programming of the dendritic cell network. Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).
  5. den Haan, J. M., Bevan, M. J. Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo. J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).
  6. Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
  7. Yamazaki, S., et al. CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells. J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).
  8. Mukherjee, G., et al. DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1. Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).
  9. Melief, C. J. Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming. Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).
  10. Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. The biology of NKT cells. Annu Rev Immunol. 25, 297-336 (2007).
  11. Benlagha, K., Bendelac, A. CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity. Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).
  12. Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
  13. Arora, P., et al. A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens. Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).
  14. Semmling, V., et al. Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs. Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).
  15. Duriancik, D. M., Hoag, K. A. The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer’s patches using flow cytometric analysis. Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).
  16. Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).
  17. Mach, N., et al. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).
  18. Vremec, D., Segura, E. The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen. Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).
  19. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
  20. Reeves, J. P., Reeves, P. A. Unit 1.9, Removal of lymphoid organs. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  21. Strober, W. Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  22. Vremec, D., et al. Maintaining dendritic cell viability in culture. Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).

Play Video

Citer Cet Article
Arora, P., Porcelli, S. A. An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets. J. Vis. Exp. (110), e53824, doi:10.3791/53824 (2016).

View Video