Summary

Un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas

Published: April 18, 2016
doi:

Summary

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Abstract

Las células dendríticas (DC) son las células presentadoras de antígeno profesionales principalmente responsable de la adquisición, procesamiento y presentación de antígenos en moléculas presentadoras de antígenos para iniciar la inmunidad mediada por células T. Las células dendríticas se pueden separar en varios subconjuntos fenotípicamente y funcionalmente heterogéneos. Tres importantes subconjuntos de células dendríticas esplénicas son plasmocitoide, células CD8a POS y CD8a Neg. Las DCs plasmacitoides son productores naturales de interferón de tipo I y son importantes para la inmunidad de células T anti-viral. El subconjunto CD8a Neg DC está especializada para MHC de clase II presentación de antígenos y está implicado en el centro de cebado de células T CD4. El CD8a Pos países en desarrollo son los principales responsables de la presentación cruzada de antígenos exógenos y sensibilización de las células T CD8. Los CD8a Pos DC han demostrado ser más eficaz en la presentación de antígenos glicolípidos por moléculas CD1d a un cel T especializadal población conocidas como células T asesinas naturales invariantes (iNKT). La administración de Flt-3 ligando aumenta la frecuencia de la migración de progenitores de células dendríticas de la médula ósea, lo que se traduce en la expansión de las células dendríticas en los órganos linfoides periféricos en modelos murinos. Hemos adaptado este modelo para purificar grandes cantidades de células dendríticas funcionales para su uso en experimentos de transferencia de células para comparar dominio in vivo de diferentes subconjuntos de DC.

Introduction

Las células dendríticas (DC) fueron descubiertos hace casi cuarenta años como el "gran estrelladas (griego dendron) celular" que se encuentra en los órganos linfoides 1. Muchos estudios han demostrado que los países en desarrollo son las únicas células que presentan antígenos que pueden estimular eficazmente las células T ingenuas 2. Una función importante de estas células es la captación y presentación de antígenos y su procesamiento eficaz y la carga de éstos a las moléculas presentadoras de antígeno. En bazo de ratón, las DC se puede separar en plasmocitoide y subconjuntos convencionales. Las DCs plasmacitoides se caracterizan por una baja expresión de CD11c y altos niveles de B220 y Gr-1. Ellos también son positivas para el marcador de superficie mPDCA1 y secretan interferón de tipo I en respuesta al número 9 como ligandos del receptor (TLR9). Las CD convencionales son demasiado altos para CD11c y MHC clase II expresión. Ellos se pueden dividir en tres subconjuntos distintos basados ​​en la expresión superficial de marcadores fenotípicos tales como CD4, CD8a, DEC205, CD11b y las células dendríticas del receptor inhibitorio 2 (DCIR2, reconocido por el anticuerpo 33D1) proteínas 3,4. Los CD8a Pos DC también se conocen como Cdc1, son positivas para DEC205, pero negativas para los marcadores mieloides tales como CD11b y 33D1. El CD8a Neg DC, también llamado cdc2, son positivos para 33D1, CD11b y CD4, pero carecen de DEC205. El subgrupo negativo doble (es decir, negativo para CD4 y CD8a) es relativamente poco frecuente, y es negativa para DEC205 y 33D1. Es el subconjunto menos caracterizado y puede ser una forma menos diferenciadas de CD8a Neg DC.

Las diferencias fenotípicas en los diferentes subconjuntos de DC se extienden también a sus funciones in vivo. El CD8a Neg los DC son altamente fagocítica y se cree que presentar el antígeno exógeno principalmente a través de MHC de clase II de células T CD4 3. Por el contrario, los países en desarrollo Pos CD8a son especializados para la presentación de antígeno de proteína soluble en MHC de clase Ien un mecanismo denominado presentación cruzada. El resultado de la presentación cruzada depende del estado de activación de estas DCs 5, y puede o bien conducir a la expansión de las células T citotóxicas (CTL) o el desarrollo de células T reguladoras 6 2,7. Focalización del antígeno a CD8a Pos DC usando resultados de la entrega mediada por anti-DEC205-anticuerpo en gran medida en la eliminación de las células T 8, mientras que la presentación de antígenos derivados de células apoptóticas infectadas induce una fuerte respuesta CTL 9.

Además del reconocimiento de antígenos peptídicos, el sistema inmune de los mamíferos ha evolucionado para reconocer los antígenos de lípidos y glicolípidos. Estos antígenos son presentados por moléculas CD1, que son proteínas de la superficie celular-I como de clase MHC que existen en múltiples formas relacionadas en diversos mamíferos. En ratones, un solo tipo de molécula de CD1 altamente conservada llamada CD1d es responsable de la presentación de antígenos glicolípidos 10. El mayor población de células T que reconocen complejos CD1d / glicolípidos se llama células NKT invariantes (células iNKT). Estas células expresan un receptor de células T semi-invariante (TCR) compuesto por una cadena invariante TCRα que se empareja con cadenas TCR que han diversidad 11 limitados. A diferencia de las células T convencionales que necesitan para proliferar y diferenciarse para convertirse en células T efectoras activadas, existen células iNKT como una población efectora y comenzar a responder rápidamente después de la administración glicolípido 12. Identificación de células presentadoras de antígeno de lípidos fisiológicamente relevante es un área activa de investigación, y se han sugerido varios tipos de células diferenciadas, tales como las células B, los macrófagos y las CD para realizar esta función. Sin embargo, se demostró que el subconjunto CD8a Pos de las DC es la célula primaria que media la captación y presentación de antígenos a las células de lípidos iNKT ratón 13 y glicolípido mediada cebado cruzado de células T CD8 14.

ove_content "> Para comparar la eficiencia de la presentación de antígenos por diferentes células presentadoras de antígenos, un enfoque directo es la transferencia de los diferentes tipos de APCs purificadas pulsadas con cantidades equivalentes de antígeno en huéspedes tratados previamente. experimentos de transferencia de células de este tipo se realiza a menudo para estudios inmunológicos. Sin embargo, la realización de estudios de transferencia con las DC tratadas ex antígeno in vivo es un reto, ya que estas células existen poblaciones tan raros en los órganos linfoides en las que constituyen menos del 2% del total de células 15. por tanto, es necesario mejorar el desarrollo de estas células en los animales donantes para aumentar la eficacia de los protocolos de aislamiento.

Se sabe que la linfoide común y progenitores mieloides comunes, que son necesarios para la generación de pDC, CD8 Pos y subconjuntos CD8 Neg DC, expresa fms relacionadas receptor tirosina quinasa 3 (Flt-3). A in vivo Flt-3 ligando (Flt-3L) administración, emigration de Flt-3 que expresan las células progenitoras de la médula ósea se incrementa, lo que resulta en el aumento de la siembra de los órganos linfoides periféricos y la expansión de su progenie madura DC 16. La expresión de Flt-3 se pierde durante el compromiso con el B, T o NK vías de diferenciación celular. Por lo tanto, sólo alteraciones mínimas se observan en estas células tras la administración Flt-3L. Expansión similares en las poblaciones de DC se observa en ratones con tumores generados por la implantación de una línea celular B16-melanoma secretoras de murino Flt-3L, que proporciona un método sencillo y económico para proporcionar niveles sistémicos sostenidos de Flt-3L 17,18. Usando este enfoque, hemos desarrollado un protocolo basado en la implantación de células B16 melanoma secretoras de Flt-3L para estimular la expansión de todos los subconjuntos normales de corriente continua en el bazo del ratón, lo que aumenta en gran medida los rendimientos de estas células que se pueden aislar para experimentos posteriores . constantemente nos encontramos con que dentro de 10 – 14 días después de im subcutáneaplantación del tumor secretor de Flt-3, los ratones desarrollan esplenomegalia marcada con el enriquecimiento de las DC para constituir 40 – 60% del total de células de bazo. A partir de estos bazos, diferentes subconjuntos de DC se pueden aislar con alta pureza usando el estándar kits de purificación de células disponibles en el mercado que emplean marcadores fenotípicos-subconjunto específico.

Protocol

Los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices aprobadas por el Comité Institucional Cuidado de Animales y el uso (IACUC). Todos los procedimientos que requieren la esterilidad se llevan a cabo en una cabina de bioseguridad. 1. Implantación de B16.Flt3L melanoma en ratones Cultura la expresión de línea de Flt-3 B16 melanoma celular en T25 matraces de cultivo tisular a una densidad de 0,5 x 10 6 células / ml en medio completo DMEM con…

Representative Results

El resultado de este procedimiento se basa en la expansión de los subgrupos de CD por murino Flt-3L expresado por las células de melanoma implantados. El tumor B16.Flt3L se derivó de un 6 mouse / C57BL, y debe ser implantado en animales con que cepa de antecedentes con el fin de evitar el fallo del tumor a establecerse debido al rechazo. En algunos casos, puede ser deseable usar ratones modificados genéticamente para derivar DCs con defectos conocidos en vías o receptores de interé…

Discussion

se aceptan las células dendríticas que es el principal antígeno profesional que presenta células que participan en el cebado de respuestas de células T. Su función principal es la de inspeccionar el microambiente del tejido mediante la adopción y el procesamiento de antígenos para la presentación a las células T. Con el fin de estudiar la función de subconjuntos específicos de DC, estos necesitan ser aislados en cantidades suficientes utilizando un enfoque que mantiene su fenotipo y las funciones normales. L…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el NIH / NIAID AI45889 subvención a SAP de citometría de flujo estudios se llevaron a cabo utilizando las instalaciones centrales de FACS apoyados por el Centro de Cáncer de Einstein (NIH / NCI CA013330) y el Centro para la Investigación del SIDA (NIH / NIAID AI51519).

Materials

0.05% Trypsin-EDTA  Life Technologies, Gibco 25300-054
Isoflurane  Sigma-Aldrich CDS019936-250MG
Collagenase D  Roche Diagnostics 11088858001
DNase I (dry powder) QIAGEN 79254
200 proof ethanol  Thermo Fisher Scientific 9-6705-004-220 Used to prepare 70% ethanol
RBC lysis buffer Sigma-Aldrich R7757
RPMI-1640 medium with L-glutamine  Life Technologies, Gibco 11875-119
DMEM medium with L-glutamine  Life Technologies, Gibco 11995-073
200 mM L-glutamine  Life Technologies 25030081
MEM non-essential amino acids  Life Technologies, Gibco 11140-050
MEM essential amino acids  Life Technologies 11130-051 
β-mercaptoethanol  Life Technologies, Invitrogen 21985-023
Sodium pyruvate  Life Technologies 11360-070
HEPES  Life Technologies, Invitrogen 15630
Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) Life Technologies, Invitrogen 20012-050
Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) Life Technologies, Gibco 14040-182
0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution  Life Technologies 15575-020
Bovine serum albumin (BSA)  Sigma-Aldrich A2153
Fetal calf serum Atlanta Biologicals S11050 
Penicillin/streptomycin  Life Technologies, Invitrogen 15140-163
Trypan blue (dry powder)  Sigma-Aldrich T6146-5G  Prepare 0.08% with PBS
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse Miltenyi Biotech 130-092-786
Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c  Miltenyi Biotech 130-152-001
CD8αPos mouse DC isolation kit  Miltenyi Biotech 130-091-169
Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) BD Biosciences 553141
Anti-mouse CD11c-FITC  BD Biosciences 553801
Anti-mouse CD8α-PerCP  BD Biosciences 553036
Anti-mouse B220-PE  BD Biosciences 553090
1 ml syringes  BD 26048
23 G1 needle  BD 305145
100 mm Petri dishes  Thermo Fisher Scientific 875712
Surgical instruments  Kent Scientific INSMOUSEKIT
Cell strainer (70 µm  BD 352350
Large Petri plates  Thermo Fisher Scientific FB0875712
Vacuum filtration system (500 ml(0.22 um  Corning 431097
LS columns  Miltenyi 130-042-401
Magnetic stand MACS separator  Miltenyi Biotec 130-042-302
Wide-bore 200 μl pipette tips  PerkinElmer 111623
Corning ultra-low attachment 96-well plates  Corning CLS3474-24EA
6-8 week old female C57BL/6 mice  Jackson Research Laboratories, Jax
Murine B16.Flt3L melanoma cell line described by Mach et al. ,2000
Serum free DMEM and RPMI media
500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine

5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM)    

5 ml HEPES Buffer (1 M)    

5 ml L-glutamine (200 mM) 

0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need.  Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system.
Complete RPMI and DMEM media Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.
MACS buffer:  Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 ug/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). 
FACS staining buffer Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer
10x Collagenase D and DNase 1 stock solution
Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca++ and Mg++ to obtain a solution of approximately 1,000-
2,000 Units of collagenase activity per ml

This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use

References

  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  3. Dudziak, D., et al. Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo. Science. 315 (5808), 107-111 (2007).
  4. Belz, G. T., Nutt, S. L. Transcriptional programming of the dendritic cell network. Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).
  5. den Haan, J. M., Bevan, M. J. Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo. J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).
  6. Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
  7. Yamazaki, S., et al. CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells. J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).
  8. Mukherjee, G., et al. DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1. Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).
  9. Melief, C. J. Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming. Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).
  10. Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. The biology of NKT cells. Annu Rev Immunol. 25, 297-336 (2007).
  11. Benlagha, K., Bendelac, A. CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity. Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).
  12. Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
  13. Arora, P., et al. A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens. Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).
  14. Semmling, V., et al. Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs. Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).
  15. Duriancik, D. M., Hoag, K. A. The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer’s patches using flow cytometric analysis. Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).
  16. Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).
  17. Mach, N., et al. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).
  18. Vremec, D., Segura, E. The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen. Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).
  19. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
  20. Reeves, J. P., Reeves, P. A. Unit 1.9, Removal of lymphoid organs. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  21. Strober, W. Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  22. Vremec, D., et al. Maintaining dendritic cell viability in culture. Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).

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Citer Cet Article
Arora, P., Porcelli, S. A. An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets. J. Vis. Exp. (110), e53824, doi:10.3791/53824 (2016).

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