Новые Метрики к характеризации эмбриональных Удлинение нематоды<em> Caenorhabditis Элеганс</em

В течение почти 50 лет нематод Caenorhabditis Элеганс зарекомендовал себя как мощная модель для изучения важных вопросов в области развития, нейробиологии, эволюции, хозяин-патоген взаимодействий и т.д. ¹ Сила этой модели в изучении развития заключается в: его короткого жизненного цикла от 3-х дней; легкость, с которой эти животные могут быть генетически изменены; его прозрачность, что позволяет наблюдать клетки перемещения и морфологии в живых животных и его развития, что в основном внематочная. Стадии развития нематоды включают эмбриогенеза и четыре личиночной стадии (L1 до L4), а затем во взрослую жизнь. Во время эмбрионального развития, эпидермальный морфогенез привлек значительное внимание на его способность дать возможность лучше понять, как эпителиальные клетки мигрируют в качестве группы, как они реорганизовать их соединений и изменять свою индивидуальную морфологию, а также их взаимное расположение в пределах функционального эпителия.Эпидермальный морфогенез делится на четыре этапа: спинной интеркаляции, состоящий в реорганизации спинные эпидермальных клеток, называют гиподермой; вентральной корпус, заключающийся в миграции брюшных гиподермальных клеток по направлению к вентральной срединной линии, таким образом, герметизирующей эмбриона в эпителиального клеточного монослоя; раннего и позднего Удлинение трансформации фасолевидных эмбриона в червеобразный личинок. Вслед за морфогенез, эмбрион люк и личинки начинают питаться L1 с использованием имеющихся бактерий в их непосредственном окружении.

Поэтому эмбриональных удлинение является поздней стадии эмбрионального развития. Она состоит из расширения зародыша вдоль его продольной оси, и уменьшение его поперечного диаметра. Это предполагает значительное изменение формы гиподермальных клеток. Удлинение делится на ранний и поздний фазы. Ранняя фаза начинается на стадии разделителями и заканчивается , когда стенки тела мышцы начинают договаривающиеся в 1,75 раза стадии шИСД типа (вес) эмбрионов – эмбрионов , соответствующие которые являются 1,75 раза в длине по сравнению с не-удлиненная эмбрионов. Морфогенетические процессы , происходящие на этой стадии, в основном за счет сокращения нитевидных актина пучков (FBS) , расположенных на апикальном полюсе гиподермальных клеток , которые управляют их удлинение вдоль передне-задней оси эмбриона ^2. Сужение FBs является контроль с помощью фосфорилирования миозина свет цепи тремя киназ LET-502 / ROCK, MRCK-1 и ПАК-1 ^5. Поздняя стадия удлинения, начинается, когда стенки тела мышцы становятся функциональными и начинают сокращаться. Она включает в себя сигнализацию механотрансдукция от стенки тела мышц к спинному и брюшные гиподермальных клеток и заканчивается , когда животные люк ^3.

Удлинение дефекты, как правило, характеризуются процент животных, умирающих эмбрионов (эмбриональной летальности; Emb) и те, арестовывая их развития как личинок L1 (фенотип личинок арест; Lvа) и быть значительно короче , чем вес. Определение стадии развития требует ареста микроскопического наблюдения мертвых эмбрионов и арестовал личинками ^3-6.

Недавно было показано , что некоторые гены, такие как регулятор Cdc42 / Rac и эффекторной PIX-1 и пак-1, контролировать процессы морфогенные как во время раннего и позднего удлинения ^3,7. Недавно мы также показали , что морфогенетические процессы отличаются вдоль передне-задней оси эмбрионов на ранних стадиях удлинения ^{3 7.} Эти результаты побудили разработку новых показателей, конкретно ориентированных на ранних или поздних стадий удлинения и другие показатели, позволяющие характеристику морфологии эмбрионов вдоль их передне-задней оси во время раннего удлинения.

Эти новые методы состоят в измерении длины эмбрионов в начале и в конце раннего удлинения, а также ширины их онобъявления и хвосты. ⁷ Два протоколы были разработаны для измерения длины только что вылупившихся личинок, синхронизированный на L1 стадии ^7.

В скорлупа из эмбрионов защищают их от щелочной обработки гипохлоритом в то время как личинки, взрослые и бактерии, присутствующие в культуральной среде растворены обработкой. Эта процедура затем используется для очистки эмбрионов из несинхронизированной населения , содержащей большинство сытых взрослых ^8. Ограничение еды используется для синхронизации только что вылупившихся личинок. Измерение длины этих личинок затем используется для обнаружения дефектов удлинения. Это измерение предпочтительнее измерения задержанных в развитии личинок на культуральных планшетах, так как личинки, которые вылупляются из не полностью удлиненные эмбрионы могут восстановить до "нормальной длины" при кормлении, но будет поддерживать их уменьшенные размеры при задержании при отсутствии пищи.

Здесь мы приводим подробные протоколы, позволяющие измерение леngth из удлиняя эмбрионов, а также ширину их головы и хвоста, используя замедленную DIC микроскопии и анализа изображений (Протокол 1). Мы также предоставляем подробные протоколы для измерения длины синхронизированной личинок с использованием анализа изображений (Протокол 2) и проточной цитометрии (протокол 3).