Novel Metrics zur Charakterisierung von Embryonic Dehnung des Nematode<em> Caenorhabditis elegans</em

Seit fast 50 Jahren gründeten die Nematode Caenorhabditis elegans sich als leistungsfähiges Modell wichtige Fragen in der Entwicklung, der Neurobiologie, evolution, Wirt-Pathogen – Interaktionen usw. ¹ Die Stärke dieses Modells in der Studie der Entwicklung zu studieren , liegt in: seiner kurzen Lebenszyklus von 3 Tagen; die Leichtigkeit, mit der diese Tiere gentechnisch verändert werden; seine Transparenz, die die Beobachtung der Zell Verschiebung und Morphologie in lebenden Tieren und deren Entwicklung, die vor allem Extrauterin- ist ermöglicht. Die Entwicklungsstadien des Nematoden umfassen Embryonalentwicklung und vier Larvenstadien (L1 bis L4), gefolgt von Erwachsenenalter. Während der embryonalen Entwicklung, zog epidermal Morphogenese beträchtliche Aufmerksamkeit auf seine Fähigkeit, um ein besseres Verständnis davon, wie Epithelzellen wandern als Gruppe zu ermöglichen, wie sie ihre junctions reorganisieren und ändern ihre individuellen Morphologie sowie deren relative Positionierung innerhalb eines funktionellen Epithels.Epidermal Morphogenese ist in vier Stufen unterteilt: dorsale Einlagerungs bestehend in der Reorganisation der dorsalen epidermalen Zellen, als der Unterhaut bezeichnet; ventralen Gehäuse, in der Migration von ventralen hypodermal Zellen in Richtung der ventralen Mittellinie aus so den Embryo in einer epithelialen Zellschicht umhüllt; Früh- und Spät Dehnung Umwandlung der bohnenförmigen Embryos in vermiform Larven. Im Anschluss an die Morphogenese, Embryo Luke und L1-Larven beginnen mit den verfügbaren Bakterien in ihrer unmittelbaren Umgebung ernähren.

Embryonic Dehnung ist daher eine späte Phase der Embryonalentwicklung. Es besteht aus der Verlängerung des Embryos entlang seiner Längsachse und eine Verringerung seines Querdurchmesser. Dies bedeutet eine drastische Änderung der Form der hypodermalen Zellen. Dehnung ist unterteilt in eine frühe und eine späte Phase. Die frühe Phase beginnt mit dem Komma Bühne und endet , wenn die Körperwand Muskeln in w bei 1,75-facher Etappenvertragsild Typ (wt) Embryonen – entsprechend Embryonen , die 1,75-fache in der Länge im Vergleich zu nicht verlängert Embryonen. Morphogene Prozesse in diesem Stadium auftreten , werden in erster Linie durch die Kontraktion von fädigen Aktinbündel (FB) am apikalen Pol hypodermal Zellen angeordnet angetrieben, die ihre Dehnung entlang der anteroposterioren Achse des Embryos ² fahren. Die Kontraktion der FBs ist die Kontrolle durch die Phosphorylierung von Myosin-Leichtketten durch drei Kinasen LET-502 / ROCK, MRCK-1 und PAK-1 ^5. Die Spätphase der Verlängerung beginnt, wenn die Körperwand Muskeln funktionsfähig werden und Contracting beginnen. Es geht um Mechanotransduktion Signalisierung von den Körperwandmuskulatur zu den dorsalen und ventralen hypodermal Zellen und endet , wenn die Tiere ³ schlüpfen.

Dehnungsfehler werden durch den Prozentsatz der Tiere als Embryonen (Embryonale Letalität; Emb) sterben im Allgemeinen gekennzeichnet und diejenigen zu verhaften ihre Entwicklung als L1-Larven (Larven Verhaftung Phänotyp; Lva) aufweist und deutlich kürzer als Gew. Bezeichnung des Stadium der Entwicklungsstopp erfordert mikroskopische Beobachtung von toten Embryonen und verhaftet Larvae ^3-6.

Es wurde vor kurzem gezeigt , dass mehrere Gene, wie die Cdc42 / Rac Regler und Effektor pix-1 und pak-1, während morphogenic Prozesse steuern sowohl frühe als auch späte Dehnung ^3,7. Wir zeigten auch vor kurzem , dass morphogenic Prozesse entlang der anteroposterioren Achse der Embryonen während der frühen Verlängerung ^{3 7} unterscheiden. Diese Erkenntnisse die Entwicklung neuer Metriken motiviert speziell frühe oder späte Verlängerung Stadien und anderen Metriken Targeting ermöglicht die Charakterisierung der Morphologie der Embryonen entlang ihrer anteroposterioren Achse während der frühen Dehnung.

Diese neuen Verfahren bestehen, um die Länge von Embryonen zu Beginn und am Ende des frühen Dehnung sowie die Breite der bei der Messung erAnzeigen und Schwänzen. ⁷ Zwei Protokolle wurden auch die Länge der frisch geschlüpften Larven zu messen entwickelt, synchronisiert auf L1 Stufe ^7.

Die Eischalen der Embryonen schützen sie gegen alkalischen Hypochlorit-Behandlung während Larven, Erwachsene und Bakterien in den Kulturmedien durch die Behandlung gelöst sind. Diese Behandlung wird dann verwendet , Embryonen zu reinigen , aus einem nicht-synchronisierten Population eine Mehrheit von gut ernährt Erwachsene ⁸ enthält. Lebensmittel Einschränkung verwendet frisch geschlüpften Larven zu synchronisieren. Messen der Länge dieser Larven wird dann verwendet, Verlängerung Defekte zu detektieren. Diese Messung wird über die Messung der verhafteten Larven auf Kulturplatten bevorzugt, da Larven, die aus nicht vollständig länglichen Embryonen schlüpfen können "normale Länge" erholen, wenn Fütterung aber ihre reduzierte Größe beibehalten, wenn in Abwesenheit von Lebensmitteln festgenommen.

Hier präsentieren wir detaillierte Protokolle ermöglichen die Messung der lenge von Embryonen sowie die Breite des Kopfes und der Schwanz mit Zeitraffer-DIC-Mikroskopie und Bildanalyse (Protokoll 1) verlängert wird. Wir bieten auch detaillierte Protokolle über die Länge der synchronisierten Larven mittels Bildanalyse (Protokoll 2) und Durchflusszytometrie (Protokoll 3) zu messen.