Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.
Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.
Onderzoekers hebben een breed scala van diermodellen gebruikt om de normale functie van het gehoorsysteem en de pathofysiologie van gehoorverlies bestuderen. Deze modellen zijn ook zeer nuttig voor het uitvoeren van interventiestudies tegen verschillende pathologische processen en dienen als basis voor translationeel toepassingen bij menselijke proefpersonen. Voor de meeste onderzoek waarbij het slakkenhuis en de bijbehorende auditieve netwerken moet een zekere mate van beschadiging of verstoring worden ingevoerd in het systeem. Vaak wordt de schade opzettelijk gericht op een specifieke laesie te creëren, zodat onderzoekers het effect van deze laesie normale functie, evenals de cochleaire herstelmogelijkheid bestuderen. Bij het selecteren van een bepaald diermodel en / of techniek (en) voor het inbrengen schade dient een aantal factoren worden beschouwd om de best mogelijke resultaten te bereiken. Verschillende diermodellen kunnen verschillend reageren op ingrepen, terwijl de directe en indirecte effecten van een techniek kan zijnvolledig schadelijk voor het gewenste resultaat. In de meeste gevallen zou het ideale binnenoor schade protocol systemische toxiciteit vermijden, snel en betrouwbaar tot schade, maakt een nauwkeurige en consistente laesie en zijn survivable voor verder onderzoek functioneel cellulaire en moleculaire veranderingen toelaten. Idealiter zouden deze werkwijzen ook behoud van de delicate microarchitectuur elektrochemische gradiënten van de cochlea om zoveel mogelijk.
Tot op heden hebben de onderzoekers er in geslaagd de oprichting van een aantal technieken om binnenoor letsel veroorzaken. De meeste inhouden blootstellen van het slakkenhuis een ototoxisch middel, hetzij systemisch of via chirurgische benadering. Technieken omvatten parenterale injectie, intraperitoneale injectie, trans-tympanische injectie, endolymfatische zak injectie en cochleostomie met perilymfatische perfusie. Deze technieken zijn gebruikt om een verscheidenheid van ototoxische middelen zoals furosemide, gentamicine, ouabain, en heptanol introduceren. 1-5Hoewel succesvol in het creëren van specifieke cochleaire laesies, de bovenstaande technieken ook hebben erkend beperkingen. Systemische injecties kunnen zeer toxisch voor het dier en kan worden geassocieerd met onbedoelde cochleaire beledigingen en inconsistente resultaten. De laatste tekortkoming is ook geassocieerd met trans-trommelvlies injecties. Technieken zoals cochleostomie en perilymfatische perfusie, maar kan induceren snelle en zeer betrouwbare laesies, direct invasief binnenoor structuur en functie. Veel chirurgische benaderingen zijn ook geassocieerd met een hoge technische moeilijkheidsgraad en vereisen waardoor vreemde voorwerpen in het dier, bijvoorbeeld een micropomp ei. 2-4,6-8 één techniek vrij van gebreken en onderzoekers moet kiezen methoden aandachtig naar hun experimentele behoeften. Hier beschrijven we in detail de ronde venster niche (RWN) applicatie techniek voor topische aflevering van ototoxische agenten in volwassen muizen.
Fieerst beschreven door Husmann et al in 1998 tijdens de studie effect gentamicine op sensorische haarcellen degeneratie bij een vogel model, werd deze techniek gevonden dat in staat is aanmerkelijk betrouwbaarder laesies dan systemisch gentamicine toepassing, terwijl het vermijden geassocieerde toxiciteit. 9 Sindsdien is een aantal andere onderzoekers, waaronder ons laboratorium, hebben deze techniek een groot succes gebruikt. In 2004, Heydt et al. aangepast aan een muismodel beschreven en een verbeterd vermogen om verwondingsgrootte te controleren door het vullen van de RWN met absorbeerbare gelatine spons gedrenkt in variërende concentraties gentamicine. 10 PALMGREN et al., in 2010, onderzocht de ototoxische effecten van beta-bungarotoxine, een krachtige element in het gif van de Taiwanese gestreepte kist, door toepassing van een waterige vorm ervan de RWN van volwassen ratten. 11 Daarnaast zijn een aantal eerdere studies in ons laboratorium de ronde venster benadering van de ototoxische effecten van furosemide studie gebruiktee, ouabain en heptanol. 5,6,12-15 De resultaten van deze studies hebben het belang van cochleaire vloeistof en ionen homeostase op normaal gehoor aangetoond, ontdekte cel proliferatieve capaciteit in de spiraal ganglion en cochleaire zijwand en bevorderd ons begrip van leeftijdsgebonden gehoorverlies.
De volgende aanpak omvat operatief toegang tot het middenoor via een postauricular incisie en gedeeltelijke unroofing van de benige trommelvlies bulla. Dit maakt goede belichting van de RWN en membraan waaraan een geselecteerde ototoxisch rechtstreeks kan worden toegepast. Het vloeibare middel dan zwembaden in de komvormige holte van de RWN (of langzaam afvoeren van een verzadigde absorbeerbare gelatine spons vervoerder verpakt in de RWN) en verspreidt door het ronde venster membraan in de perilymfatische ruimte van het cochleair vestibule. Geen directe cochleostomie wordt in deze benadering. De voordelen van deze techniek zijn onder behoud van binnenoor microarchitectuur, vermijdingvan systemische toxiciteit, rekening van een intra-dierlijke controle ear, snel begin van werking, selectieve degeneratie in bepaalde cochleaire celtypen (bijv. type I spiraal ganglion neuronen met ouabain belichting en cochleaire type II fibrocytes geïnduceerd door de behandeling van heptanol), en reproduceerbare / betrouwbare resultaten. Deze techniek kan worden toegepast met enkele aanpassingen tussen andere soorten knaagdieren, zoals ratten, cavia's en gerbils. Nadelen zijn een steile technische leercurve en de relatieve beperking van ototoxic belediging die is beperkt tot een enkel punt in de tijd.
Het protocol en representatieve resultaten hierboven beschreven werden verkregen in een KBA / CAJ muismodel inclusief beide geslachten. Dit inteeltstam is goed opgezet als een "goed gehoor" standaard en 'normale veroudering' model in het horen van het onderzoek. 16-23 Omschrijving van het gebruik van dit protocol in andere zoogdieren modellen valt buiten het bestek van deze tekst. De lezer dient er echter op dat de RWN applicatietechniek biedt verscheidene voordelen voor het bestuderen van zoogdieren binnenoor. Hiervan zijn de meest opvallende is dat het voorkomt direct verstoring van de delicate anatomische structuur en biochemische gradiënten die binnen de wanden van de otic capsule. Procedures zoals cochleostomie en implantatie van infuuspompen hebben de neiging om direct schenden binnenoor structuren leiden tot permanente verschuivingen drempel; een feit dat rekening moet worden gehouden bij het analyseren van de resultaten. Verstoring van cochleaire zijwand structuren door invasieve methods kan ook het gebruik van ototoxische middelen zoals furosemide of heptanol, waarvan de specifieke zone effect beperkt is op die locatie. 15,24 Alternatieve niet-invasieve benaderingen zoals trans-tympanische injectie en parenterale injectie werden geplaagd door onbetrouwbare resultaten en beperken / of systemische toxiciteit voor het diermodel. Deze applicatiemethode is gebleken dat beide tekortkomingen te vermijden, om een niveau van consistentie benaderen die van de meer invasieve werkwijzen hierboven besproken.
Andere voordelen van deze techniek omvatten is de brede toepasbaarheid op een aantal diermodellen en haalbaarheid te nemen in een bestaande labinfrastructuur. Bij dit laatste wordt geen speciale reagentia of chemicaliën afgezien vereist van de gekozen ototoxische middelen, anesthetica en analgetica. Ototoxische middelen worden typisch gebruikt bij een vaste concentratie en gemengd in een voldoende grote hoeveelheid van oplossing (5 ml) voor lange tijd duren overwegening elke toepassing gebruikt ongeveer 10 gl (bij muizen). Dus na de eerste bevoorrading en instrumenten, onderzoekers betrekkelijk vrij van tijdrovende oplossingspreparaat of frequente vervanging van materialen. Deze techniek heeft ook verlagingen operatieduur, die aanzienlijk kunnen zijn in vergelijking met procedures waarbij implantatie van perilymphatic infusiepompen of cochleostomies. Bij het bereiken van een niveau van technische bekwaamheid, onze gemiddelde doorlooptijd van de initiële incisie te sluiten was typisch 20 minuten tot 1,5 uur, afhankelijk van de duur van de blootstelling gewenst voor het ototoxische middel. Drie of vier operaties kan gemakkelijk in een enkele dag worden ingevuld, waardoor verhoogde efficiëntie en verhoogde kans op het verkrijgen van goede resultaten. Zoals hierboven beschreven, kan deze techniek ook gemakkelijk worden toegepast op een verscheidenheid van diermodellen zoals muizen, ratten, cavia's en woestijnratten.
Beperkingen van deze methode zijn gericht op dematig steile leercurve nodig om het te beheersen en verminderde verwachte resultaten tot technische vaardigheid is bereikt. Zoals in meer detail zal worden besproken, zullen kleine fouten tijdens de chirurgische ingreep of onvoldoende visualisatie van het operatieveld bijna altijd tot een slechte uitkomst. Subtiele bevindingen dat een beginner kan falen te herkennen, zoals een sub-millimeter dikke luchtbel blokkeren van de toegang van de agent om de ronde venster membraan of interstitiële vloeistof verdunnen van de agent, neem de tijd om te waarderen en de psychomotorische vaardigheden die nodig zijn om ze te corrigeren ontwikkelen. Echter, met herhaalde uitvoering van de procedure deze hindernissen overwonnen gemakkelijk en vormen een minder enorme technische uitdaging voor onderzoekers dan sommige van de bovengenoemde invasieve methoden. Tenslotte wordt deze techniek gekoppeld aan de relatieve beperking dat cochleaire schade alleen kunnen worden geïnduceerd op één tijdstip tijdens de chirurgische blootstelling. Dit kan worden overwonnen om een zekere mateDoor het vullen van de RWN met absorbeerbare gelatine spons met het agens zoals beschreven door Heydt et al. 10 De absorbeerbare gelatinespons zal resorberen tijd, maar kan zorgen voor een langere blootstellingsperiode dan bereikt door toepassing van een waterige oplossing alleen is.
Om een onderzoeker om de volledige voordelen van deze techniek te realiseren en valkuilen voorkomen, is het essentieel om de twee essentiële onderdelen van deze techniek herkennen: 1) de aanhoudende visualisatie van het middenoor ruimte RWN handhaven; en 2) het vermogen om de chirurgische gebied vrij van interstitiële vloeistof en / of bloed te houden. Bij het bereiken van de eerste van deze, kan het belang van een goede kop-houder niet genoeg worden benadrukt. Veilige fixatie van het hoofd van het dier zorgt voor een stabiele weergave onder de microscoop; waarvan het belang wordt snel duidelijk als subtiele instrumentatie drastisch verandert de positionering van structuren onder vergroting. Een goede hEAD houder die kan roteren rond het dier rostrale-caudale as vergemakkelijkt ook de belangrijke dynamische veranderingen in de lijn van de site van de onderzoeker. Vaak kan enkele millimeters rotatie om deze as het verschil tussen visualisering van de RWN en visualisatie van alleen de otic capsule bot betekenen. Het vermogen om te veranderen voortdurend uitzicht is ook het grootste belang om ervoor te zorgen interstitiële vloeistof goed is verwijderd uit de diepten van de niche en ook dat de ototoxic stof volledig is verwijderd tussen applicaties zoals besproken in deel 5. In onze ervaring, bloed, condensatie, of interstitiële vloeistof dat komt in de middenruimte oren heeft de mogelijkheid te verstoren gehele experiment. Dit is niet verwonderlijk, omdat de kleine hoeveelheid ototoxische middel aangebracht op de ronde venster (~ 10 pi) kan gemakkelijk worden verdund door in contact met zelfs kleine hoeveelheden vreemde vloeistof. Om deze reden is nauwgezette chirurgische dissectie en fragmentaire niet-bedekkende van het trommelvlies bulla en zorgvuldige corrosie Mion van het stapediale slagader neer op een succesvolle experimentele resultaten.
Als de bovenstaande kritische stappen worden waargenomen en verwachte resultaten zijn nog steeds niet bereikt, moet het oplossen van problemen beginnen. In onze ervaring, is het vaak nuttig om het proces variaties van twee procedurele elementen uit te voeren. De eerste is de frequentie waarmee het ototoxische middel wordt bijgevuld in de ronde venster te wijzigen. Afhankelijk van het middel dat wordt gebruikt, de totale belichtingstijd ligt tussen 30 minuten en 1 uur, met volledige wicking en daaropvolgende vervanging van het middel per 10 min. Als bloot voor kortere looptijden, waardoor de totale blootstelling kan toestaan dat de agent meer tijd om te verspreiden over het ronde venster membraan. Extra belichting en suppletie kan ook helpen om ongewenste verdunning van het ototoxische middel vermijden door bloed, condensatie, of interstitiële zoals hierboven besproken. Voorzichtigheid moet worden gehandhaafd bij het gebruik van deze benadering is echter, omdat het de neiging om de kans op onbedoeld vergrotenly verwonden de stapediale slagader en / of invoering interstitiële vloeistof aan de RWN.
Deze techniek is belangrijk in wat het biedt te onderzoeken van cochleaire fysiologie en pathofysiologie. Deze minimaal invasieve techniek maakt gedetailleerde studie van gevoelige biochemische processen en is gelijk is in het bevorderen het onderzoek ter beoordeling van cochleaire regeneratief potentieel. 12,24 Deze chirurgische benadering en belichting wordt ook weergegeven in een verscheidenheid van andere technieken uitloper en succesvolle resultaten met deze methode zijn gemeld in studies van cochleaire implantatie stamcellen. 14 Veel blijft onbekend over het slakkenhuis, maar deze techniek, samen met de bredere instrumentarium beschikbaar voor onderzoekers, zal helpen bij het verkleinen van deze kennis kloof.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by National Institutes of Health (NIH) Grant number: NIH P50DC00422 (H.L.); NIH R01DC12058 (H.L.). This work also benefitted from the South Carolina Clinical and Translational Research Institution (SCTR) Clinical and Translational Science Award (NIH/NCRR UL1RR029882). The funders had no role in study design, data collection, and/or analysis. The authors would like to thank Lonnie E. Brown Jr. for his artistic and graphic contributions.
1-Heptanol 98% | Sigma-Aldrich | H2805 | PubChem Substance ID 24895536 |
250ML | |||
Ketaset Injectable | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Concentrate 100mg/ml |
(Ketamine HCl) | 10ml | Schedule CIII controlled substance | |
Anased Injectable | Lloyd Laboratories | NADA# 139-236 | Concentrate 20mg/ml |
(Xylazine) | |||
Buprenex Injectable | Patterson Veterinary | 07-850-2280 | Concentrate 0.3mg/ml |
(Buprenorphine HCl) | 5 ampules per box | Schedule CIII controlled substance | |
Betadine Skin Prep Solution | Medline | MDS093941 | 1 Quart screw top bottle |
(Povidone-Iodine) | |||
0.9% Sterile Saline | Variable | N/A | For mixing solutions and injections |
Table of Equipment, Surgical Instruments, and Specific Techniques | |||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
Operating Microscope | Carl Zeiss | 32192 | |
Controlled Acoustics Environment Sound Booth | Industrial Acoustics Company | N/A | |
Surgical Head Holder | Custom Made – | Please see Figure 3 | |
Medical University of South Carolina | |||
Neck Soft-Tissue Retractor (Wire Speculum, Titanium) 1.75inch | World Precision Instruments | 555801L | Maximum spread 20mm |
Embedded in disposable putty to affix dynamically to head holder | |||
90N Dental Belt Driven Hand Drill | Emesco | N/A (Vintage Item) | |
Scalpel Handle Size6 | Bard-Parker | MEDC-011990 | |
#15c Stainless Steel Surgical Scalpel Blade | Bard-Parker | SKU: 097-7215 | 50 Blades/Box |
Via ACE Surgical Supply Code | |||
Straight Tip Jewelers Forceps | Bernell | MIL17304 | |
Iris Scissors Curved | Medline | DYND04026 | |
Iris Scissors Straight | Medline | DYND04025 | |
Stevens Tenotomy Scissors Straight | Medline | MDG3222111 | |
Rosen Ear Needle Straight Shaft, Lightly Curved Tip | MytaMed | Item# 6.56.00 | Figure 1 demonstrates angled shaft picks. This was later substituted for the Rosen picks |
Rosen Ear Needle Straight Shaft, Strongly Curved Tip | MytaMed | Item# 6.56.01 | |
Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | CODE 34155 | White, Size 4.4×8.4 Inch. Cut to triangles and rolled into fine tip wicks. |
House Ear Curette, 6” shaft, light angle | Medline | MDG0396486 | |
Gelfoam (absorbable gelatin sponge) Size 100 | Medline | IIS34201 | Substitutions may be made |
Cotton pellets #3 4mm | Richmond | Manufacturer Code 100108 | |
ElectroSurgical Unit 100 E M/M | Elmed | List No. 52-5770 | Bipolar and Monopolar Capable |
1cc U-100 Insulin Syringe 28G, 0.5” length needle | BD | Product Number: 329410 | Optional for delivery of Ototoxic agent |
23G, blunt tip, 1” length needle | Kendall | Product Code 8881202397 | For controlled delivery of Ototoxic agent with less risk of damaging stapedial artery |
Surgical Mask | U-line | S-10478 | |
Exam Grade Nitrile Surgical Gloves | U-line | S-12549 | |
Precision Hair Clippers | Wahl | N/A | Multiple models may be substituted |
5-0 Nylon black monofilament suture on PC-1 13mm 3/8 circle needle | Ethilon | 1855G | Substitutions may be made. |
Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisher | 01-812054 | |
Dry Sterilizer | ROBOZ | Germinator TM 500 | |