L'approche de la souris ronde-fenêtre pour ototoxiques Delivery Agent: Un rapide et fiable Technique d'incitation à Cochlear dégénérescence cellulaire

Tous les aspects de la recherche sur les animaux ont été menées en conformité avec les lignes directrices de la Commission institutionnelle soin et l'utilisation des animaux approprié. Toutes les procédures expérimentales sur des animaux vertébrés décrites ici ont été approuvés en vertu des lignes directrices de l'Université médicale de Comité (MUSC) Institutionnel soin et l'utilisation des animaux de la Caroline du Sud (IACUC). 1. Sélection du modèle Maintenir le modèle animal dans un vivarium de faible bruit avec gardiennage de routine par des protocoles institutionnels jusqu'à utilisation. Dans la recherche de l'animal (des installations ARF), maintenir la stabilité des vibrations, le bruit d'amortissement, l'éclairage diurne, l'espace de préparation, finitions de surface, d'étanchéité et de calfeutrage, et la ventilation qui répondent aux normes NIH. Nota: National Institutes of Health (NIH) des lignes directrices pour ARF et le maintien d'un faible vivarium de bruit peuvent être révisées à: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/ Pour toutes les expériences, utiliser l'oreille droite que l'oreille expérimentale. L'oreille gauche sert de contrôle intra-animaux et n'a pas modifié chirurgicalement. Inspectez l'animal modèle pré-opératoire des signes d'infection de l'oreille moyenne ou externe. Signes potentiels peuvent inclure le drainage du fluide ou du pus de l'oreille, le tissu enflammé pavillon de l'oreille, et / ou de la léthargie de l'animal. Ceci est inhabituel, mais si noté, en outre éviter la chirurgie et de traiter l'animal de manière appropriée. 2. Les procédures pré-opératoires Anesthésier l'animal 30 min avant l'intervention chirurgicale et les procédures périopératoires via intrapéritonéale (IP) injection de kétamine (100 mg / kg IP) et de xylazine (20 mg / kg IP). Supplément anesthésie selon les besoins, tel que jugé par un réflexe pincement pincement positif, avec une dose plus faible de kétamine (25 mg / kg IP) et de xylazine (5 mg / kg IP). Déterminer dosage en conformité avec les protocoles acceptés sur le plan institutionnel pour les souris avec l'âge des ajustements appropriés de la dose. Vérifiez completedation du modèle. Vérifiez pour un plan de 3 étapes de l'anesthésie pour l'intégralité du protocole décrit marquée par un taux de respiration régulière, un manque de réflexe de redressement (chez la souris), et le manque de pédale et palpébrale (TOE-pincement) réflexes. Maintenir l'animal à ce niveau de l'anesthésie. Ceci est primordial pour la minimisation de la douleur et le mouvement peropératoire, saignements, et la fuite de fluides interstitiels pendant la chirurgie. Maintenir la température du corps de l'animal à 37,5 ° C avec un tampon de chauffage à boucle fermée. Administrer l'analgésie par injection sous-cutanée de la buprénorphine. Livrer la buprénorphine (0,1 mg / kg SQ fois 30 min avant la chirurgie) que l'analgésie pour minimiser l'inconfort chirurgicale. Dosage et alternatives base appropriée pour le modèle choisi sur les protocoles approuvés institutionnellement. Antibiotiques utilisation ne soit pas nécessaire si une bonne technique aseptique a été pratiqué. Les animaux reçoivent une analgésie post-opératoire, si il ya des signes de douleur et de détresse. Effectuer phessais ysiologic préopératoire. Exécution du tronc cérébral (ABR) test auditif et / ou un produit de distorsion des tests d'émissions optoacoustic (DPOAE) à la fois en pré-opératoire et juste avant le sacrifice de l'animal sert une mesure objective de l'effet de l'agent ototoxiques choisie sur l'audience de la souris. 3. Préparation chirurgicale et positionnement Stériliser tous les instruments de pré-opératoire par les normes institutionnelles. Préparer les instruments chirurgicaux et domaine d'une manière cohérente, stérile, et organisé pour éviter des efforts inutiles et de mouvement pendant la procédure. Les instruments typiques tenus comprend des ciseaux de dissection pointus, plusieurs paires de pinces métalliques avec les conseils de bijoutier, un pic otologique, une curette otologique, et une unité de l'électrocoagulation bipolaire (Figure 1). Préparer et stériliser mèches de papier fabriqué à partir labwipes à l'avance en coupant une petite pièce triangulaire de la lingette (~ 0,7 po x 1,25 po x 1.75) et en tournant fermement entre le pouce et l'index d'une main (~ 1,25). Création d'un torsadées mèche, extrêmement mince est primordiale pour le succès de la procédure. Préparer un total de 15-20 mèches avant la chirurgie (Figure 2). Utilisez une fraise de dentiste pour perforer rapidement l'os de la bulle tympanique d'une manière contrôlée. Utilisation d'une perceuse à main dentaire à entraînement par courroie avec un embout 1 ou 2 mm conique est préférable. Un microscope opératoire est nécessaire de compléter le protocole. (voir l'étape 4.7) Pré-tirer 0,2 ml d'une solution aqueuse contenant l'agent ototoxiques sélectionnée dans une seringue de 1 ml de tuberculine avec un 28 G, 1/2 'aiguille. Typiquement, une goutte (~ 10 pi) de l'agent est suffisante pour remplir complètement le RWN de la souris. Un métallique, émoussé aiguille pointe de la seringue facilite la délivrance de l'agent, tout en empêchant les dommages aux structures sous-jacentes par une pointe conique pointu. Expulser l'air intérieur de la seringue sous forme de bulles peuvent remplir par inadvertance le RWN et / ou empêcher le bonapplication de l'agent à la fenêtre ronde elle-même. Retirer la fourrure de la peau post-auriculaire aide de tondeuses de toilettage électriques. Retirer la fourrure dans une zone allant de l'enclave auriculo-céphalique rostralement à la caudale de la ceinture scapulaire. Elargir l'épilation de la dorsale, la ligne médiane sagittale à l'angle mandibulaire latéralement. Élimination correcte de la fourrure est primordiale pour maintenir un champ opératoire propre et claire. Brosser coupures du site chirurgical destiné doucement. Stériliser la peau de la zone préparée conformément aux protocoles institutionnels. Appliquer la bétadine (povidone / iode) en alternance avec de l'éthanol par voie topique d'une manière circulaire pendant 2 min. D'autres agents peuvent être substitués par des directives institutionnelles. Placez l'animal sur une surface plane pour maintenir constant le positionnement du corps pendant la procédure. Utiliser un petit coussin chauffant placé sous le corps sur la plate-forme pour contrôler la température du corps pendant la procédure afin de maintenir la température du corps de l'animal à 36-38 ° C. Ne pas overheat l'animal, car cela pourrait conduire à légère à de graves lésions cutanées et / ou l'euthanasie précoce. Fixer la tête de l'animal au moyen d'un dispositif de retenue bloc de morsure / tête. Utiliser un 0,5 cm par 2 cm bloc de morsure usiné laiton avec 2-4 trous mm de diamètre percés à travers elle à intervalles de 5 mm le long de l'axe de temps. Ouvrez la bouche de l'animal autour de cet appareil et monter les incisives centrales supérieures dans l'un des trous selon la taille de l'animal. Serrer doucement une petite pince sur le dos du museau de l'animal pour le maintenir en place (Figure 3). Assurez-vous que le titulaire bloc / de la tête de morsure est rigidement relié au centre d'un bras articulé en forme de U (Figure 3). De garantir une large tige 1cm sur le bras gauche de la «U» et utilisez la tige comme un appui-tête du côté gauche (le côté droit est toujours le côté opérationnel). Une fois solidement fixé dans le support de la tête, tourner la souris à une position décubitus latéral gauche. Placez le savou du corpslly sur la surface de travail plane pour assurer qu'elle sera stable tout au long de la procédure et d'éviter les contraintes de torsion excessive sur les vertèbres cervicales. Positionner un microscope opératoire capable de 4x, 10x, 20x grossissement et sur le champ opératoire. Vérifiez que le microscope peut maintenir sa position dans un mode mains-libres que ce qui est idéal pour le protocole chirurgical à deux mains discuté ci-dessous. Placez une unité de cautérisation bipolaire compatible avec la pièce à main de fine embout bijoutier dans une position qui est immédiatement disponible pour l'assistance dans la cautérisation de petits vaisseaux et la dissection du tissu. Ce peut également être nécessaire devrait être saignements plus abondants rencontré. 4. Approche chirurgicale Sous grossissement microscopique, utiliser des ciseaux pointus ou une lame de scalpel pour créer une incision rétro-auriculaire 1-1,5 cm, environ 6-8 mm caudale au pli auriculocephalic. Chez la souris adulte, une incision de la ligne médiane dorsalelatéralement à un point près de l'angle de la mandibule est adéquate. Eviter soigneusement couper profondément pour préserver les structures vasculaires sous-jacentes. Mener dissection minutieuse à travers la couche de graisse sous-cutanée qui peut être d'épaisseur variable. Fat peut être retiré en toute sécurité si nécessaire à l'amélioration de l'exposition. Prenez garde en disséquant dans une direction ventrale médiale que la veine jugulaire externe traverse cette région et les dommages à cette structure peut causer de grandes quantités de perte de sang et les inondations du champ opératoire. Contrôler les saignements excessifs avec des éponges de gélatine absorbables et / ou des boulettes de coton. Utilisez cautérisation bipolaire pour des saignements plus abondants. Une fois la couche de graisse est correctement divisé, exposer la musculature cervicale. Remarque structures importantes, y compris le grand corps musculaire des cleidomastoideus centrale dans le domaine de la chirurgie exposée, la veine jugulaire externe ventre, et le tissu recouvrant la parotide rostralement l'angle de la mandibule. Une étape importante est une petite Branc nerveuseh (du nerf crânien XI) qui entoure le bord postérieur / dorsale de la cleidomastoideus d'étendre rostralement vers le pavillon de l'oreille (Figure 4). Rétracter doucement le corps cleidomastoideus musculaire dans une direction postérieure / dorsale (figures 4, 5). Diviser délicatement le fascia transparente enveloppant le corps musculaire. D'une manière similaire, rétracter doucement la parotide et la veine jugulaire externe dans la (antérieure / ventral) en direction opposée (figure 5). Avec une bonne rétraction du corps cleidomastoideus musculaire, le dôme brillant de la bulle tympanique périoste entrera en vue (figure 6). A la partie caudale de la bulle, l'insertion d'un muscle profond col de l'utérus, l'sternomastoideus, entrera en vue (figure 6). Préserver le nerf facial, qui devient visible à la dorsale et l'aspect rostrale de la coupole de la bulle. Placer un écarteur auto-retenue (titane stérile shaft– intégré dans silicone jetablecoller) avant le forage. Avec une technique à deux mains, doucement diviser le périoste de bulle par diathermie bipolaire pour exposer l'os sous-jacent. En utilisant une pince ou une curette otologique, élever doucement et poussez le périoste dans une direction périphérique à largement exposer le dôme de bulle. Nota: L'étape 4.6 est essentiel pour maximiser la vue chirurgical de l'espace de l'oreille moyenne. Utiliser la manipulation minutieuse et doux tissu doux pour éviter les saignements et / ou de fuite de liquide interstitiel dans la cavité de la bulle après le forage. Sur un dôme de bulle correctement exposée, percer un trou pilote de 2 mm dans l'os de la bulle avec une perceuse chirurgicale dentaire entre la marge caudale de la coupole et la ligne visiblement opaque (représentant la membrane tympanique) étendant à travers l'aspect rostrale de la bulle (Figure 7). Prenez soin de ne percer à travers l'os de préserver des structures sous-jacentes, telles que l'artère stapédienne. Percez un second trou pilote à proximité pour faciliter l'ONU de la toiture de l'os de la bulle (<strong> Figure 7). En utilisant une paire de pointes des pinces de bijoutier, décapsuler l'os de la bulle dans une dorsale et direction caudale (figure 8). Retirer l'os de façon fragmentaire à fort grossissement. Ne pas percer l'artère stapédienne, qui se trouve directement sous le bouchon de bulle, comme des saignements de cette artère peut compromettre la procédure. Réduire la quantité d'os retiré pour empêcher l'entrée excessive de liquide dans l'oreille moyenne, tout en permettant une excellente visualisation et l'accès à la fenêtre ronde (figure 8). 5. ronde Fenêtre de l'application de l'agent ototoxique Faire des ajustements subtils à rotation le support de tête pour amener le RWN carrément en vue. Le RWN se trouve généralement à l'aspect dorsal et caudal de l'espace de l'oreille moyenne et apparaît comme un renfoncement en forme de coupelle de la capsule otique osseuse. Dans la plupart des cas, l'artère stapédienne fonctionne 1-2 mm ventrale / rostrale à cela. Le RWN peut parfois être tucked périphérique sous une angulation aiguë de la coupole de la bulle. Dans de tels cas, le positionnement minutieux de la tête de l'animal est primordiale. Utiliser les mèches de papier préparés préopératoire, enlever tout le liquide visible dans l'oreille moyenne et RWN jusqu'à l'os sec est visualisée. Note: Ceci est l'étape la plus critique de l'ensemble du protocole, comme ~ 10 pi (1 goutte) d'agent ototoxiques appliqué à la RWN peut facilement être dilué par ce fluide. Sous grossissement maximum, utiliser une aiguille de calibre fin sur un 1 ml seringue à tuberculine d'appliquer une goutte (~ 10 pi) de l'agent ototoxiques directement à la RWN, le remplir complètement. Prenez soin de ne pas perturber l'artère stapédienne et observer de près pour le remplacement d'une petite réflexion de la lumière à la base d'une niche à sec avec un ménisque de fluide ternes et brumeux comme un indicateur que la niche se remplit correctement. Laisser l'agent de se reposer dans le RWN pour environ 10 min temps d'exposition. Après cela, complètement wbeurk sur l'agent et la remplacer par une nouvelle application du même agent. Déterminer répétitions d'application selon les spécifications de l'agent. Le temps d'exposition total de cette procédure est généralement comprise entre 30 et 60 min. À la fin de la procédure, complètement évacuer l'agent une dernière fois et d'appliquer l'agent frais au RWN. Laissez la bulle non plafonné et utiliser des pinces pour fermer les tissus mous sur le site chirurgical. Sceller site chirurgical au niveau de la peau avec un 4-0, non absorbable suture monofilament. Placez l'animal dans une cage de récupération / station. Surveiller l'état clinique de l'animal régulièrement après l'opération. Maintenir l'animal dans des conditions d'environnement appropriées, y compris le logement avec une literie douce et la supplémentation avec des aliments mous, de minimiser le stress. Déterminer les futures procédures et conditions post-opératoires selon les protocoles institutionnels IACUC. Utilisez protocoles institutionnels IACUC pour stériliser instruments avant de l'utiliser sur l'animal suivant. Prévoir une période de refroidissement approprié entre l'utilisation de l'instrument. 6. Procédures postopératoires et récolte de tissus Cochlear Comme décrit dans l'étape 2.5, effectuer des tests physiologiques de l'audition après l'opération à des points désirés et avant le sacrifice. Exécuter les procédures postopératoires selon les objectifs expérimentaux. Sacrifier l'animal sur un jour postopératoire souhaitée. Après anesthésie générale par injection IP, tel que requis par les protocoles institutionnels IACUC, sacrifier l'animal. Avec des ciseaux pointus, décapiter animaux juste caudale à l'occiput. Fortement ouvrir la voûte crânienne avec des ciseaux le long de la dorsale et ventrale et médiane largement répandu. Évider délicatement le tissu cérébral pour exposer l'os temporal. Remarque: Un certain nombre de procédures d'enquête des modifications post-exposition dans la cochlée peut se ramifier à partir de ce point et sera mentionné dans la section de discussion. Déterminer la méthode d'enquête le plus pertinent aux buts expérimentaux. Si la microscopie électronique est prévue après la cochlée sont sectionnés, utiliser cathétérisme cardiaque pré-fixer le tissu. Ceci est au-delà de la portée de cette discussion et a été couvert en profondeur ailleurs. 13 Couper les os temporaux de la base du crâne avec les ciseaux et immédiatement placé dans la solution de fixation. Plongez os directement dans 4% de paraformaldehyde pendant 1,5 heure à température ambiante. Surveiller le temps de fixation, qu'une plus longue durée peut limiter le résultat de l'analyse histologique à des étapes ultérieures. Détartrage disséqué os pendant une période de temps variable par immersion dans 1 mM d'acide éthylène diamine (EDTA).