A abordagem do rato Round-janela para ototóxicos Delivery Agent: A rápida e técnica confiável para induzir a degeneração das células da cóclea

Todos os aspectos da pesquisa animal foram conduzidos de acordo com as orientações do Comitê Animal Care Institucional e uso apropriado. Todos os procedimentos experimentais em animais vertebrados descritos aqui foram aprovadas sob as diretrizes da Universidade Médica da Comissão (MUSC) Institutional Animal Care e Uso da Carolina do Sul (IACUC). Seleção 1. Modelo Manter o modelo animal em um viveiro de baixo ruído com guarda de rotina por protocolos institucionais até estar pronto para uso. Em pesquisas com animais instalações (ARFs), manter a estabilidade de vibração, amortecimento de ruído, iluminação diurna, espaço de preparação, acabamentos de superfície, vedação e calafetagem, e ventilação que cumprem as normas do NIH. Nota: Institutos Nacionais de Saúde (NIH) diretrizes para ARFs e manutenção de um baixo ruído viveiro pode ser revista em: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/ Para todos os experimentos, use a orelha direita como na orelha experimental. A orelha esquerda serve como um controlo intra-animais e não é alterada cirurgicamente. Inspecione o modelo animal pré-operatório para detectar sinais de infecção do ouvido médio ou externo. Sinais potenciais podem incluir a drenagem de fluido ou pus do ouvido, tecido inflamado pavilhão auricular, e / ou letargia do animal. Isso é incomum, mas se observou, evitar mais cirurgias e tratar o animal de forma adequada. 2. Os procedimentos pré-operatórios Anestesiar o animal 30 minutos antes da cirurgia e quaisquer procedimentos perioperatórios via intraperitoneal (IP) de injecção de cetamina (100 mg / kg ip) e xilazina (20 mg / kg IP). Suplemento anestesia, conforme necessário, tal como avaliado por um reflexo positivo de igual pitada, com uma dosagem inferior de cetamina (25 mg / kg ip) e xilazina (5 mg / kg IP). Determinar a dosagem em conformidade com os protocolos institucionalmente permitidos para camundongos com idade de ajustamentos adequados dose. Verifique se há plena sedation do modelo. Verifique se há um estágio 3 plano de anestesia para a totalidade do protocolo descrito marcada por uma taxa de respiração regular, a falta de reflexo de endireitamento (em ratos), e falta de pedal e palpebral (toe-pitada) reflexos. Manter o animal a este nível de anestesia. Isso é fundamental para a minimização da dor e do movimento intra-operatória, sangramento e vazamento de líquidos intersticiais durante a cirurgia. Manter a temperatura do corpo do animal a 37,5 ° C com uma almofada de aquecimento de circuito fechado. Administrar analgesia através de injecção subcutânea de buprenorfina. Deliver buprenorfina (0,1 mg / kg SQ uma vez 30 minutos antes da cirurgia) como analgesia para minimizar qualquer desconforto cirúrgico. Dosagem de base e as alternativas adequadas ao modelo selecionado em protocolos institucionalmente aprovados. Uso de antibióticos não é necessário se boa técnica asséptica tem sido praticada. Os animais recebem analgesia pós-operatória se há sinais de dor e sofrimento. Execute physiologic testes pré-operatório. Execução de tronco encefálico (ABR) o teste auditivo e / ou produto de distorção testes de emissões optoacoustic (EOAPD), tanto no pré-operatório e apenas antes do sacrifício do animal serve como uma medida objetiva para o efeito do agente ototóxico escolhido em audição do mouse. 3. Preparação cirúrgica e Posicionamento Esterilizar todos os instrumentos de pré-operatório por normas institucionais. Prepare instrumentos cirúrgicos e campo de uma forma consistente, estéril, e organizada para evitar esforços desnecessários e movimento durante o procedimento. Instrumentos típicos exigida inclui tesouras de dissecação afiados, vários pares de pinças metálicas com dicas de joalheiro, um picador de otológica, uma cureta otológica, e uma unidade de eletrocautério bipolar (Figura 1). Prepare e esterilizar mechas de papel feitas de labwipes com antecedência pelo corte de um pequeno pedaço triangular da limpeza (~ 0,7 em x 1,25 em x 1.75 in) e torcendo-a com força entre o polegar eo indicador de uma mão (~ 1,25 in). Criação de um pavio extremamente fina firmemente torcida é fundamental para o sucesso do procedimento. Preparar um total de 15-20 mechas antes da cirurgia (Figura 2). Use uma broca de dentista para perfurar rapidamente o osso da bula timpânica de uma forma controlada. O uso de uma broca de mão dental acionado por correia com uma ponta de 1 ou 2 mm cônico é preferível. Um microscópio operatório é necessário para completar o protocolo. (veja o Passo 4.7) Pré-desenhar 0,2 ml de uma solução aquosa contendo o agente ototóxico seleccionado dentro de uma seringa de tuberculina de 1 ml com um 28 g, 1/2 'agulha. Tipicamente uma gota (~ 10 ul) do agente é suficiente para encher completamente o RWN rato. A metálico, agulha ponta da seringa sem corte facilita a administração do agente, evitando danos às estruturas subjacentes por uma ponta afiada de bisel. Expelir o ar no interior da seringa como bolhas pode inadvertidamente encher o RWN e / ou prevenir adequadaaplicação do agente à janela redonda si. Retire a pele da pele pós-auricular usando cortadores de higiene elétricos. Retire a pele em uma zona que se estende desde o vinco aurículo-cefálica rostralmente ao caudal cintura escapular. Estender a remoção do cabelo do dorsal, na linha média sagital ao ângulo mandibular lateralmente. Remoção adequada da pele é fundamental para a manutenção de um campo cirúrgico limpo e claro. Escove suavemente recortes de sítio cirúrgico pretendido. Esterilizar a pele da área preparada por protocolos institucionais. Aplicar betadine (povidona / iodo) alternadas com etanol topicamente de um modo circular durante 2 min. Outros agentes podem ser substituídos por diretrizes institucionais. Colocar o animal sobre uma superfície plana para manter o posicionamento do corpo constante durante o processo. Utilize uma pequena almofada de aquecimento colocada por baixo do corpo para a plataforma para controlar a temperatura do corpo durante o processo para manter a temperatura corporal do animal em 36-38 ° C. Não overheat o animal, pois isso pode levar a leve a lesões cutâneas graves e / ou eutanásia cedo. Fixe a cabeça do animal através de um aparelho de suporte de bloco de mordida / cabeça. Utilizar um 0,5 cm por 2 cm bloco de mordida usinado de latão com buracos de 2-4 mm de diâmetro perfurados por ela em intervalos de 5 mm ao longo do eixo longo. Abra a boca do animal em todo este acessório e se encaixam os incisivos centrais superiores em um dos buracos, dependendo do tamanho do animal. Aperte levemente uma pequena braçadeira sobre o dorso do focinho do animal para segurá-la no lugar (Figura 3). Confirmar que o suporte de bloco / cabeça da mordida está rigidamente ligado ao centro de um braço articulado em forma de U (Figura 3). Fixe uma haste de 1 centímetro de largura para o braço esquerdo do "U" e usar haste como um descanso principal do lado esquerdo (o lado direito é o lado operacional). Uma vez firmemente fixado no suporte de cabeça, gire o mouse para uma posição de decúbito lateral esquerdo. Posicione o corpo carefully na superfície plana de funcionamento para garantir que será estável durante todo o procedimento e evitar a tensão de torção indevida sobre as vértebras cervicais. Posicione um microscópio cirúrgico capaz de 4x, 10x, 20x e sobre o campo cirúrgico. Confirmar que o microscópio pode manter a sua posição de um modo mãos-livres tal como este é ideal para o protocolo cirúrgico de duas mãos discutido abaixo. Coloque uma unidade de cautério habilitado para bipolar com peça de mão do joalheiro de ponta fina em uma posição que está imediatamente disponível para a assistência na cauterização de pequenos vasos e dissecção do tecido. Isto pode também ser necessário um sangramento mais pesado deve ser encontrado. 4. Abordagem Cirúrgica Sob ampliação microscópica, use uma tesoura afiada ou uma lâmina de bisturi para criar uma incisão postauricular 1-1,5 cm, cerca de 6-8 mm caudal ao vinco auriculocephalic. No ratinho adulto, uma incisão de linha média dorsallateralmente a um ponto perto do ângulo de mandíbula é adequada. Evitar o corte cuidadosamente profundamente para preservar estruturas vasculares subjacentes. Realizar cuidadosa dissecação romba através da camada de gordura subcutânea que pode ser de espessura variável. A gordura pode ser removida de forma segura, se necessário para uma melhor exposição. Tome cuidado ao dissecar em uma direção ventral-medial como a veia jugular externa atravessa esta área e danos a essa estrutura pode causar grandes quantidades de perda de sangue e inundações do campo cirúrgico. Controlar qualquer sangramento excessivo com esponjas de gelatina absorvíveis e / ou bolinhas de algodão. Use cautério bipolar para um sangramento mais pesado. Uma vez que a camada de gordura é adequadamente dividido, expor a musculatura do colo do útero. Nota estruturas importantes, incluindo o corpo grande músculo dos cleidomastoideus centralmente no interior do campo cirúrgico exposto, a veia jugular externa ventralmente, e o tecido da parótida rostral sobrepondo o ângulo de mandíbula. Um marco importante é um pequeno nervo branch (XI do nervo craniano) que circunda o bordo posterior / dorsal do cleidomastoideus estender rostral para o pavilhão auricular (Figura 4). Suavemente retrair o corpo muscular cleidomastoideus em uma direção posterior / dorsal (Figuras 4, 5). Gentilmente dividir a fáscia transparente que envolve o corpo muscular. De um modo semelhante, a retrair suavemente parótida e veia jugular externa na frente (anterior / ventral) o sentido (Figura 5). Com boa retracção do corpo de músculo cleidomastoideus, a cúpula brilhante do periósteo bula timpânica entrará em vista (Figura 6). No aspecto caudal do bula, a inserção de um músculo do colo do útero mais profundo, o sternomastoideus, vai entrar em vista (Figura 6). Preservar o nervo facial, que se torna visível na parte dorsal e rostral aspecto da cúpula bula. Coloque um afastador de auto-retenção (titânio estéril shaft– incorporado em silicone descartáveiscolar) antes da perfuração. Com a técnica de duas mãos, gentilmente dividir o periósteo bula, com diatermia bipolar para expor o osso subjacente. Utilizando uma pinça ou uma cureta otológica, gentilmente elevar e empurre o periósteo numa direcção periférica para expor amplamente a cúpula bula. Nota: Etapa 4.6 é crítica para maximizar a visão cirúrgica do espaço do ouvido médio. Utilize manipulação dos tecidos moles meticuloso e delicado para evitar sangramento e / ou vazamento de fluido intersticial na cavidade bula após a perfuração. Após uma cúpula de bolha com uma exposição adequada, faça um furo piloto 2 milímetros através do osso bula com uma broca cirúrgica dental entre a margem caudal da cúpula e da linha visivelmente opaca (representando a membrana timpânica) que se estende em todo o aspecto rostral da bolha (Figura 7). Tome cuidado para perfurar somente através do osso para preservar as estruturas subjacentes, como a artéria estapediano. Perfurar um segundo furo piloto nas proximidades para facilitar un-cobertura do osso bula (<forte> Figura 7). Usando um par de fórceps ponta do joalheiro, uncap o osso bolha em um dorsal e direção caudal (Figura 8). Retirar o osso de forma fragmentada sob alta ampliação. Não perfurar a artéria estapediano, que fica logo abaixo da tampa bula, como sangramento desta artéria pode comprometer o procedimento. Minimizar a quantidade de osso removido para evitar a entrada excessiva de líquidos para o ouvido médio, enquanto ainda permitindo excelente visualização e acesso ao nicho da janela redonda (Figura 8). 5. Rodada Janela de Aplicativo de ototóxicos Agent Fazer ajustes rotacionais sutis para suporte da cabeça para trazer o RWN diretamente à vista. O RWN normalmente está localizado no aspecto dorsal e caudal do espaço da orelha média e aparece como um recuo do tipo copo do osso cápsula ótica. Na maioria dos casos, a artéria estapediana corre 1-2 mm ventral / rostral a esta. O RWN às vezes pode ser tucked perifericamente sob uma angulação aguda da cúpula bula. Em tais casos, o posicionamento cuidadoso da cabeça do animal é primordial. Usando os pavios de papel preparados no pré-operatório, remover todo o fluido visível na orelha média e RWN até osso seco é visualizado. Nota: Este é o passo mais importante de todo o protocolo, como a ~ 10 ul (1 gota) de agente ototóxico aplicada ao RWN pode facilmente ser diluído por este fluido. Sob ampliação máxima, use uma agulha de calibre fino em uma seringa de 1 ml de tuberculina para aplicar uma gota (~ 10 l) de agente ototóxico diretamente ao RWN, enchendo-o completamente. Tome cuidado para não perturbar a artéria estapediano e observar de perto para a substituição de uma pequena reflexão da luz na base de um nicho seque com um maçante e nebulosas menisco fluido como um indicador de que o nicho é preencher corretamente. Permitir que o agente para descansar dentro do RWN para o tempo de exposição de aproximadamente 10 min. Depois disto, completamente Wick o agente e substituí-la por uma nova aplicação do mesmo agente. Determinar repetições de aplicação de acordo com as especificações do agente. O tempo total de exposição a este processo varia, tipicamente, entre 30 a 60 min. No final do procedimento, pavio completamente afastado do agente de uma última vez e aplicar o agente de fresco para RWN. Deixar a bula destapados e utilizar uma pinça para fechar o tecido mole sobre o local cirúrgico. Selar local da cirurgia ao nível da pele com uma 4-0, a sutura de monofilamento não absorvível. Colocar o animal em uma gaiola de recuperação / estação. Monitorar a condição clínica do animal na sequência de regularidade da operação. Manter o animal em condições ambientais adequadas, incluindo a habitação com roupa de cama macia e suplementação com alimento macio, para minimizar o estresse. Determinar os procedimentos futuros e condições pós-operatórias de acordo com os protocolos IACUC institucionais. Use protocolos IACUC institucionais para esterilizar instrumentoss antes de usar no próximo animal. Permitir tempo resfriamento adequado entre o uso de instrumento. 6. Os procedimentos pós-operatórios e Coclear colheita Tissue Tal como descrito no passo 2.5, realizar o teste fisiológico da audição no pós-operatório em pontos desejados e antes do sacrifício. Realizar procedimentos pós-operatórios de acordo com objetivos experimentais. Sacrificar o animal em qualquer dia de pós-operatório desejado. Após a anestesia completo através de injeção IP, conforme exigido por protocolos institucionais IACUC, sacrificar o animal. Usando uma tesoura afiada, decapitar animais apenas caudal ao occipital. Acentuadamente abrir a caixa craniana com uma tesoura ao longo da dorsal e ventral e se espalhou amplamente. Delicadamente retire o tecido cerebral para expor os ossos temporais. Nota: Uma série de procedimentos para investigação de alterações pós-exposição na cóclea pode ramificar a partir deste ponto e será mencionado na seção de discussão. Determine o método de investigação mais relevant para os fins experimentais. Se microscopia eletrônica está prevista após a cóclea são seccionadas, utilize o cateterismo cardíaco pré-fixar o tecido. Isso está além do escopo desta discussão e tem sido abordado de forma aprofundada em outros lugares. 13 Corte os ossos temporais para fora da base do crânio com a tesoura e imediatamente colocado em solução fixadora. Imergir ossos directamente em paraformaldeído a 4% durante 1,5 h à TA. Monitorar tempo de fixação, como a longa duração pode limitar o resultado da análise histológica em etapas posteriores. Descalcificar dissecados ossos por um período de tempo variável via submersão em 1 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).