To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.
El hígado tiene una gran capacidad de regeneración. Los hepatocitos, las células parenquimatosas del hígado, se puede regenerar en una de dos maneras: la regeneración del hígado hepatocyte- o biliar impulsada. En la regeneración de los hepatocitos del hígado impulsada, los hepatocitos en regeneración se derivan de hepatocitos preexistentes, mientras que, en la regeneración biliar impulsada, los hepatocitos en regeneración se derivan de las células epiteliales biliares (BEC). Para la regeneración del hígado hepatocitos impulsada, hay excelentes modelos de roedores que han contribuido de manera significativa a la comprensión actual de la regeneración del hígado. Sin embargo, no existe tal modelo de roedores para la regeneración hepática biliar impulsada. Recientemente hemos informado en un modelo de lesión hepática pez cebra en el que las BEC ampliamente dan lugar a hepatocitos en caso de pérdida de hepatocitos grave. En este modelo, los hepatocitos se ablación específicamente por un medio de farmacogenéticos. Aquí presentamos en detalle los métodos para la ablación de los hepatocitos y analizar el proceso de regeneración del hígado impulsado por la BEC.Este modelo de ablación específico de hepatocitos se puede utilizar más para descubrir los mecanismos moleculares y celulares subyacentes de la regeneración hepática biliar impulsada. Además, estos métodos pueden ser aplicados a las pantallas químicos para identificar pequeñas moléculas que aumentan o inhiben la regeneración del hígado.
El hígado es un órgano altamente regenerativa. Durante la regeneración del hígado, la regeneración de los hepatocitos, las células del parénquima del hígado, se derivan de los hepatocitos preexistentes (regeneración hepática hepatocitos impulsada) o BEC (regeneración hepática biliar impulsada) 1,2. La lesión hepática por lo general provoca la proliferación de los hepatocitos preexistentes; sin embargo, cuando se ve comprometida la proliferación de hepatocitos, las BEC puede contribuir a los hepatocitos 2-4. Estos dos modos de regeneración del hígado son clínicamente significativos. Tras la eliminación quirúrgica de una porción del hígado humano (por ejemplo, a causa de tumores en el hígado o donantes de hígado vivos), los hepatocitos en el hígado restante proliferan para recuperar la masa hepática perdido. Por el contrario, en pacientes con enfermedades hepáticas graves, la proliferación de hepatocitos se ve comprometida en gran medida, de modo que las BEC o células progenitoras del hígado (LPC) parecen contribuir a la regeneración de los hepatocitos 5,6. El modelo de roedor 2/3 hepatectomía parcial, en la quehepatocitos proliferan para recuperar la masa hepática perdido, ha contribuido de manera significativa a la comprensión actual de hepatocitos impulsada por la regeneración del hígado 7,8. Sin embargo, no existe un modelo de roedores válida en la que los hepatocitos en regeneración se derivan principalmente de las BEC. Aunque varios modelos de roedores de la toxina del hígado condujeron a la identificación de biliar impulsada por la regeneración del hígado 2-4, los estudios de linaje rastreo recientes en ratones indican una contribución mínima de las BEC a la regeneración de los hepatocitos en estos modelos 9,10. Algunos de los modelos de lesión del hígado de roedores, incluyendo la hepatectomía parcial 11-13 y daño hepático inducido por acetaminofeno-14,15, se han aplicado a pez cebra y llevado a la identificación de nuevos genes o vías implicadas en la regeneración del hígado. Sin embargo, impulsado hepatocitos, pero no conducido-BEC, la regeneración del hígado se produce en estos modelos de lesión de hígado de pez cebra. Por lo tanto, un modelo de lesión hepática novela en la que BEC contribuyen ampliamente a regenerating hepatocitos es necesario para una mejor comprensión de la regeneración del hígado impulsado por la BEC.
Los objetivos generales del modelo de ablación hepatocitos describen aquí son (1) para generar un modelo de lesión hepática en la que BEC contribuyen ampliamente a los hepatocitos en regeneración, y (2) a dilucidar los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a la regeneración del hígado impulsado por la BEC. La hipótesis de que la gravedad de la lesión determina el modo de regeneración del hígado; por lo tanto, predijo que la regeneración hepática biliar impulsada iniciaría tras la lesión del hepatocito severo. Para probar esta hipótesis, hemos desarrollado un modelo de lesión hepática pez cebra mediante la generación de una línea transgénica, Tg (fabp10a: PPC-NTR) S931, que expresa altamente nitrorreductasa bacteriana (NTR) fusionada con la proteína fluorescente cian (PPC) en el marco del fabp10a específico de hepatocitos promotor. Desde NTR convierte el profármaco no tóxico, metronidazol (Mtz), en un fármaco citotóxico, se extirpa sólo el destinado NTR-las células que expresan 16-18, en este caso, los hepatocitos. Mediante la manipulación de la duración del tratamiento Mtz, la extensión de la ablación de los hepatocitos puede ser controlada. El uso de este modelo, se informó recientemente que en caso de pérdida de hepatocitos grave, BEC ampliamente dan lugar a hepatocitos en regeneración 19, lo que fue confirmado por otros dos estudios independientes 20,21. Por lo tanto, en comparación con el roedor antes mencionado y modelos de lesión de hígado de pez cebra, nuestro modelo de ablación de hepatocitos es más ventajoso para el estudio de la regeneración del hígado impulsado por la BEC.
Este protocolo se describe el procedimiento para llevar a cabo experimentos de regeneración hepática mediante el modelo de ablación hepatocitos pez cebra. Este modelo será apropiado para determinar los mecanismos subyacentes a la regeneración hepática biliar impulsada y para pantallas químicos para identificar pequeñas moléculas que pueden reprimir o aumentar la regeneración del hígado.
Severa, pero no leve, la ablación de hepatocitos provoca la regeneración hepática biliar impulsada. Por lo tanto, después del tratamiento Mtz y de lavado, es importante para examinar el tamaño del hígado de las larvas tratadas-Mtz, que puede ser evaluada por fluorescencia intrínseca de la PPC fabp10a: CFP-NTR transgén. Desde un pequeño porcentaje de las larvas tratadas-Mtz mostrará no separada por ablación (0-5%) o parcialmente ablación (10-20%) hígados, es esencial para ordenar y sólo analizar la…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Drs. Hukriede and Tsang for discussions. M.K. was supported by an NIH training grant (T32EB001026). This work was supported in part by grants from the American Liver Foundation, the March of Dimes Foundation (5-FY12-39), and the NIH (DK101426) to D.S.
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. | ||
10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |