To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.
De lever heeft een grote capaciteit om te regenereren. Hepatocyten, de parenchymale cellen van de lever kan regenereren op twee manieren: hepatocyte- of gal aangedreven leverregeneratie. In-hepatocyte gedreven leverregeneratie, regenereren hepatocyten afkomstig van reeds bestaande hepatocyten, terwijl in-gal gedreven regeneratie, regeneratie van hepatocyten zijn afgeleid van gal epitheelcellen (BEC). Voor-hepatocyte gedreven leverregeneratie, zijn er uitstekende knaagdieren modellen die aanzienlijk hebben bijgedragen aan de huidige kennis van de lever regeneratie. Er bestaat echter geen dergelijke knaagdier model voor gal gedreven leverregeneratie. We hebben onlangs gemeld op een zebravis leverschade model waarin BEC uitgebreid tot hepatocyten na ernstige hepatocyte verlies. In dit model worden hepatocyten specifiek geablateerd door farmacogenetische middel. Hier presenteren we in detail de methoden om hepatocyten ablatie en de BEC-gedreven lever regeneratieproces analyseren.Dit hepatocyt-specifieke ablatie model kan verder worden gebruikt om de onderliggende moleculaire en cellulaire mechanismen van biliaire aangedreven leverregeneratie ontdekken. Bovendien kunnen deze werkwijzen worden toegepast om chemische schermen van kleine moleculen die uitbreiding of onderdrukken leverregeneratie identificeren.
De lever is een sterk regeneratieve orgaan. Tijdens leverregeneratie, regenereren levercellen, de parenchymcellen van de lever, zijn afgeleid van reeds bestaande hepatocyten (hepatocyte-gedreven lever regeneratie) of BEC (gal gedreven lever regeneratie) 1,2. Leverbeschadiging teweegbrengt gewoonlijk de verspreiding van latente hepatocyten; Wanneer echter de proliferatie van levercellen wordt aangetast, BEC kan bijdragen tot hepatocyten 2-4. Deze twee modi van de lever regeneratie zijn klinisch significant. Na chirurgische verwijdering van een gedeelte van de menselijke lever (bijvoorbeeld wegens levertumoren en levende leverdonor), hepatocyten in de lever resterende prolifereren de lever massaverlies herstellen. Daarentegen, bij patiënten met ernstige leverziekten, proliferatie van levercellen sterk aangetast, waardoor BEC of progenitorcellen (LPCs) lijken bij te dragen tot hepatocyten regenereren 5,6. De knaagdieren 2/3 gedeeltelijke hepatectomie model, waarinhepatocyten verspreiden naar de lever massa verloren te herstellen, heeft aanzienlijk bijgedragen tot de huidige kennis van-hepatocyte gedreven leverregeneratie 7,8. Er is echter geen geldige knaagdier model waarin hepatocyten regenereren voornamelijk afkomstig van BEC. Hoewel verscheidene knaagdier lever toxine modellen heeft geleid tot de identificatie van biliaire aangedreven leverregeneratie 2-4, recent lineage tracing studies in muizen wijzen op een minimale bijdrage van BEC te regenereren hepatocyten in deze modellen 9,10. Enkele knaagdier leverbeschadiging modellen, waaronder gedeeltelijke hepatectomie 11-13 en acetaminophen geïnduceerde leverschade 14,15, zijn toegepast op zebravis en leidde tot de identificatie van nieuwe genen en routes die betrokken zijn in leverregeneratie. Echter, hepatocyt-gedreven, maar niet BEC-gedreven, lever regeneratie plaatsvindt in deze zebravis leverschade modellen. Daarom is een nieuw leverschade model waarin BEC schaal bijdragen tot regenerating hepatocyten is nodig voor een beter begrip van BEC-gedreven lever regeneratie.
De algemene doelstellingen van de hepatocyt ablatie model hier beschreven zijn (1) een leverschade model waarin BEC schaal bijdragen tot hepatocyten regenereren, en (2) ophelderen van de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen BEC-driven leverregeneratie genereren. Onze hypothese was dat de ernst van de blessure bepaalt de wijze van leverregeneratie; dus we voorspeld dat gal gedreven leverregeneratie zou starten op ernstige hepatocyte letsel. Om deze hypothese te testen, hebben we een zebravis leverschade model door het genereren van een transgene lijn, Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931, die sterk tot uitdrukking bacteriële nitroreductase (NTR) versmolten met cyaan fluorescente eiwit (GVB) in het kader van de hepatocyt-specifieke fabp10a promoter. Aangezien NTR zet de niet-giftige prodrug, metronidazol (Mtz), een cytotoxisch geneesmiddel, dat ablates alleen de bedoelde NTR-expressie brengen 16-18, in dit geval, de hepatocyten. Door het manipuleren van de duur van Mtz behandeling, kan de omvang van hepatocyten ablatie worden gecontroleerd. Met behulp van dit model hebben wij onlangs gemeld dat men krijgt bij zware hepatocyt verlies, BEC uitvoerig leiden tot hepatocyten regenereren 19, die verder werd bevestigd door twee onafhankelijke studies 20,21. Daarom is in vergelijking met voornoemde knaagdieren en zebravis leverbeschadiging modellen ons hepatocyten ablatie model is voordeliger voor het bestuderen BEC-driven leverregeneratie.
Dit protocol beschrijft de procedure voor het uitvoeren van leverregeneratie experimenten met de zebravis hepatocyte ablatie model. Dit model is geschikt voor het bepalen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan-gal gedreven lever regeneratie en chemische schermen om kleine moleculen die kunnen onderdrukken of versterken leverregeneratie identificeren.
Serieus, maar niet mild, hepatocyte ablatie lokt-gal gedreven leverregeneratie. Daarom na Mtz behandeling en washout, is het belangrijk om de grootte van de lever Mtz behandelde larven, die kan worden bepaald door intrinsieke fluorescentie van de CFP fabp10a onderzoeken: CFP-NTR transgen. Aangezien een klein percentage van de Mtz behandelde larven niet-geablateerde (0-5%) of gedeeltelijk geablateerd (10-20%) levers weergegeven, is het noodzakelijk om uit slechts analyseren de larven met een zeer kleine lever, d…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Drs. Hukriede and Tsang for discussions. M.K. was supported by an NIH training grant (T32EB001026). This work was supported in part by grants from the American Liver Foundation, the March of Dimes Foundation (5-FY12-39), and the NIH (DK101426) to D.S.
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. | ||
10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |