Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.
פלישה של רקמות הסובבות נורמליות נחשבת בדרך כלל להיות סימן היכר מרכזי של ממאיר (בניגוד לשפיר) גידולים. לסוגים מסוימים של סרטן בפרט (לדוגמא, גידולים במוח כגון multiforme גליובלסטומה וקרצינומה של תאי קשקש של הראש וצוואר -. SCCHN) הוא סיבה לתחלואה קשה ויכולים להיות גם בהיעדרו של גרורות מרוחקות סכנת חיים. בנוסף, סרטן שההישנות לאחר טיפול למרבה הצער לעתים קרובות נוכחי עם פנוטיפ אגרסיווי יותר. לכן, יש הזדמנות למקד את התהליך של פלישה לספק טיפולים חדשניים שיכול להיות משלימים לסוכנים אנטי-שגשוג סטנדרטיים. עד עכשיו, אסטרטגיה זו כבר הקשתה על ידי חוסר מבחני חזקים, שחזור מתאימים לניתוח מפורט של פלישה ולהקרנת סמים. כאן אנו מספקים שיטת מיקרו-צלחת פשוטה (המבוסס על מדים, spheroids גידול 3D להרכבה עצמית) שיש לו פוטנציאל גדול לסטו כגוןמת. אנחנו מדגימים את פלטפורמת assay באמצעות קו אנושי תא גליובלסטומה וגם מודל SCCHN בי הפיתוח של התנגדות נגד הקולטן לגורם צמיחת אפידרמיס ממוקד מעכבים (EGFR) קשור עם פוטנציאל מטריצה פולשנית משופר. כמו כן אנו מספקים שתי שיטות חלופיות של כימות חצי אוטומטי: אחת באמצעות הדמיה cytometer ושני שפשוט דורש ללכוד מיקרוסקופיה ותמונה רגילה עם ניתוח תמונה דיגיטלי.
פיתוח תרופות נגד הסרטן קלאסי הוא ממוקד במידה רבה על השימוש במבחני חוץ גופייה מבוסס תאים למסך לחומרים ציטוטוקסיים המעכבים התפשטות תאים סרטנית ו / או לקדם מוות מתוכנת של תאים (אפופטוזיס). לאחרונה, מאמצים עברו לטיפולים ממוקדים בפיתוח מעכבי הגורמים המולקולריים שבבסיס של התפשטות תאים ממארת. למרות כמה תוצאות מרהיבות, סוכנים כאלה הקשורים לעתים קרובות עם ההתפתחות המהירה של עמידות לתרופות. בהתחשב בכך שזה הפוטנציאל פולשני וגרורתי של תאים סרטניים שאחראית למרבית מקרי מוות מסרטן, וכי מחלת הישנות לעתים קרובות מציגה פנוטיפ אגרסיווי יותר, זה הגיוני גם לשקול משלים במודלים ניסיוניים מבחנה 1,2 לזהות רומן סוכנים שימנעו "סימני ההיכר" אלה נוספים מפתח של הסרטן.
במהלך התקדמות ממארת, תאי גידול לרכושהיכולת לפלוש לרקמות שמסביב ו / או להפיץ לאיברים מרוחקים (גרורות). תאים סרטניים לחדור את הקרום במרתף על ידי ההיווצרות של invadopodia 3,4. מבנים אלה מועשרים בסיבים אקטין, חלבוני הדבקה ספציפיים וproteinases וקולקטיביים אחראים לתנועתיות של תאי גידול והשפלה של מטריקס (ECM) 5. Invadopodia להאריך לתוך ECM והם האמינו להיות חשובים לפלישת תאים סרטניים וגם extravasation לערוצי כלי דם, להקל hematogenous הפצה (או הלימפה) וגרורות.
שיטות מקובלות כיום להעריך פלישת תאים סרטניים במבחנה כוללת את הבאים. מבוסס transwell או מבחני קאמריים בוידן 2,6 בי השעיות תא בודדות הם זורעים על גבי מסנן מצופה בשכבה עבה של חלבונים המופק מECM. תאים אז לפלוש ולעבור לתא התחתון בתגובה לכימותרפיה-attractant. ECM הנפוץחלבונים הם סוג אני קולגן, או מטריצת מרתף כמו קרום (BMM, למשל, Matrigel, הנגזרת מהגידול EHS 7) המחקה את ההרכב הטבעי של ממברנות מרתף.
כחלופה למבחני סוג תא וידן מבוססת מסנן 8, יכולים להיות שנזרעו תאים על גבי ג'ל ECM (שניתן להוסיף fibroblasts) שבו הם יוצרים monolayer ולאחר מכן בנפרד או ביחד לפלוש לתוך הג'ל. פלישה ניתן למדוד במונחים של מספר התאים פולשים ו / או מרחק שעובר ממשטח ג'ל 9. תאים סרטניים יכולים גם להיות מוטבעים לחלוטין לתוך מטריצה או כהשעית תא בודדת או כspheroids – בדרך כלל ממוקם בין שתי שכבות של ג'ל ECM מאפשרות לתאים לפלוש מחוץ למסת הגידול לתוך המטריצה מקיפה 2,6,10,11.
Assay תלת ממדי (3D) אליפטית גידול הפלישה המתוארת כאן מספק מערכת מהירה, automatable פלישה באמצעות highlשיטת y לשחזור, סטנדרטית 12 בפורמט צלחת 96-היטב עם אליפטית אחד בכל טוב. BMM מתווסף כל גם ישירות לספק מטריצת חצי מוצקה שאליו תאים סרטניים לפלוש מהגוף אליפטית. של פלישת תאים סרטני המידה מנוטרת במרווחים על פני תקופה של 72-96 שעות. שיטה זו מספקת את היתרונות הבאים על מבחני פלישה הנוכחיים במבחנה שהוזכרו לעיל: גידול תאים מאורגנים במבנה 3D מחקה מייקר אזור גידול או מיקרו-גרורות; spheroids הגידול הוא מאוד לשחזור בגודל; assay הפלישה מתבצע באתר באותה הצלחת כמו פיתוח אליפטית גידול, ללא הצורך להעביר אותם לצלחות המשניות; השיטה, בשילוב עם הטכנולוגיות החדישות ביותר של ניתוח תמונה אוטומטי, מאפשרת הן תכולה גבוהה ותפוקה גבוהה מנתח של פלישת תאים סרטניים.
ניתוח התמונה מתבצע באמצעות הדמיה cytometer, אשר סורק 96-היטבצלחת בתוך 10 דקות. על ידי שימוש ביישום המפגש, השיעור של פלישת המידה ולהשיג גם על ידי תאים בודדים או על ידי צבירי תאים מתפשטים החוצה מspheroids הגידול ופולש לתוך המטריצה ניתן למדוד באופן דינמי. לתפוקה נמוכה יותר, שיטה חלופית לניתוח תמונה מוצגת, המבוססת על השימוש במיקרוסקופ הפוכה ותוכנת הדמיה סטנדרטית.
שני דגמי הגידול מתוארים כאן (גליובלסטומה וSCCHN) נבחרו במיוחד כדי להדגים assay 3D שלנו כפי שהם קליניים סרטן פולשני המקומי רלוונטי עם צורך מסופק לטיפולים יעילים 12. בעקבות טיפול תרופתי, הערכה במבחנה שינויי pharmacodynamic סמן ביולוגי (PD) יכול להתבצע בקלות על ידי כתם או immunoassays של lysates המערביים בעקבות השימוש בחומרים כימי זמינים מסחרי ספציפיים כדי לאפשר התאוששות תא מBMM ו / או ניתוח immunofluorescent של פלישת spheroids גידול על ידי כל צביעת הר.
assay הפלישה זוהי טכניקה שימושית להערכה מהירה ושחזור של פלישת תאים סרטניים למדיום מוצק למחצה, ולכן מתאימה במיוחד לעתיד בהקרנת סמים מבחנה. תאים סרטניים לפלוש המטריצה באופן 3D כפי שהם פרושים מ" מיקרו-גידול ", מיוצג על ידי אליפטית הגידול, ולהרחיב לextracellulסביבה כמו מטריקס-AR. תלת-ממדית האמיתית של assay ניכר במורפולוגיה התא, שהוא שונה מהמורפולוגיה השטוחה, תאים חסיד להניח בעת מעבר על מצע מוצק. התואר של פלישה הוא לכמת בקלות תוך שימוש בהדמיה cytometer, המאפשר אוטומטי לקריאה החוצה, או על ידי שימוש במיקרוסקופ רגיל בשילוב עם תוכנת הדמיה. יתר על כן, שיטה זו מתאימה להדמיה ניאון 13 (לדוגמא עם שורות תאים לבטא חלבונים או ניאון מראש שכותרתו עם צבעי ניאון).
השיטה היא פשוטה לביצוע עם השלב הקריטי רק מיוצג על ידי התוספת של BMM, כאשר קיים סיכון של הפרעה לעמדה של אליפטית במרכז בצורה U-היטב. זה יכול לגרום לניתוח תמונה הכי מוצלח, עם spheroids במטוסי מוקד שונים. לכן זה קריטי כדי להוסיף BMM בזהירות ולאט לאט זה טוב. לאחר תוספת BMM רצוי כדי לבדוק את הצלחתתחת מיקרוסקופ ואם הלוקליזציה נחשבת מקובלת, זה ניתן לתיקון על ידי צנטריפוגה העדינה. עם ניסיון, זה רק לעתים נדירות יש צורך. בעוד ששיטה זו היא חזקה ומאוד לשחזור, וריאציה בין-ניסיונית עלולה להתרחש עם קבוצות שונות של BMM. כדי להימנע מכך, מומלץ לרכוש BMM מספיק מתצווה אחת כדי להשלים סדרה של מחקרים.
מגבלה של השיטה (כמו לכל מבחני כאלה) היא הקושי בהבחנה בין הפלישה והתפשטות, שתאי הגידול צפויים לעבור במהלך מסגרת זמן assay. למרות זמן ההכפלה של תאים יכול להילקח בחשבון, או מעכבי מחזור התא כגון cytochalasin D הציגו, זה לא קל לשלוט או בבירור להבחין בין שני היבטים שונים אלה של התקדמות גידול, במיוחד לתאי גידול גדלו במהירות ועבור אלה ש יש דפוס יותר "רחב", ולא הסתנן, פלישה. מהסיבה הזוהוא הציע שassay צמיחת 3D מקביל מתבצע כדי לבדוק את ההשפעות ספציפיות של כל סוכנים מעכבים או גירוי. אם מחקרי תגובת מינון זהיר מבוצעים, זה עשוי להיות אפשרי כדי לבחור ריכוזים שלמזער את ההשפעות על התפשטות. לדוגמא שהראינו כי Hsp90 מעכב 17-AAG מעכב U-87 פלישת אליפטית גידול MG 3D כבר בשעה 24 ובריכוזים נמוכים ריכוז עיכוב צמיחת 3D ב -50% (GI 50) 12.
מצד השני, את המשמעות של assay זה בהשוואה למבחני פלישה סטנדרטית אחרים (למשל, מבחני סינון מבוסס או פלישה של תאים בודדים למטריצות 1 3D), הוא שתאים סרטניים לפלוש לתוך המטריצה מקיפה מאליפטית, שדומה " מיקרו-גידול "או" מיקרו-גרורות ", ולכן לוקח בחשבון היבטים חשובים של הפתופיזיולוגיה של מסת גידול. אנו מציגים השיטה מספקת מידע עלהתנהגות קולקטיבית של תאים סרטניים, כאשר בתחילה לעזוב את spheroids, וגם באופן אישי, כאשר תאים בודדים להגיע אזורים מרוחקים יותר בBMM. בנוסף, תאים בתוך הגידול spheroids עלולים לחוות מחסור היפוקסיה ומזין אשר, דרך שינויים בביטוי גנים, יכול לקדם את ההגירה ופלישה; תכונות כגון נעדרות במבחני 2D. יתר על כן, כל זה הוא זמין בפורמט תפוקה גבוהה באמצעות השימוש בלוחות 96-גם ספציפיים וטכנולוגיית ההדמיה האחרונה, מאפשר assay 3D מורכב יותר לשמש בקלות ביעד אימות וגילוי תרופות.
אנו מציגים שיטה יכולה להכיל יישומים נוספים כדי לטפל בהיבטים נוספים של פלישת תאים סרטניים. בפרט, מורכבות נוספת ניתן בחזון על ידי התוספת של תאי מארח, כגון fibroblasts ו / או בתאי האנדותל, לעצמו או אליפטית המטריצה שמסביב. זה גם יכול להיות שונה, לא רק במונחים של נוקשות (על ידי השימוש בשיתוף שונהncentrations של BMM), אלא גם במונחים של הרכב (על ידי התוספת של רכיבים אחרים תלויים ברקמה / איבר המסוים של המודל שאומץ על הגידול: למשל, tenascin לסרטן המוח 16 וקולגן לסרטן השד 17).
הגדרה דומה (דור של spheroids והדמיה) יכולה גם להיות מותאם כדי להעריך פלישת רקמה ב3D, שבו spheroids גידול הוא שיתוף תרבותי עם גופי embryoid הדומים רקמה מורכבת 12 או עם organoids תא ספציפי אחר (למשל, האסטרוציטים ל תרבויות גליומה 18 או קריפטה לסרטן במערכת העיכול), אבל עבודה נוספת נדרשת על מנת לאפשר ניתוח תמונה אוטומטי.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Web address |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | http://www.corning.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
Cultrex Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3432-005-01 | http://www.trevigen.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
Ultra-low attachment 96-well plate | Corning | 7007 | http://www.corning.com |
EGF | Miltenyi Biotec | 130-093-825 | http://www.miltenyibiotec.com Add 100 µl 1% BSA (w/v) in water to 100 µg EGF. To 25 µl of this, add 4,975 µl RHB-A medium to give a 10 µg/ml working stock. Aliquot and store at -20ºC |
RHB-A medium | Stem Cells Inc. | SCS-SF-NB-01 | http://www.stemcellsinc.com For diluting EGF |
DMEM | GIBCO | 31966-021 | http://www.lifetechnologies.com/ Warm in 37 °C waterbath before use |
Fetal Bovine Serum | Biosera | 1001/500 | http://www.biosera.com Heat at 56 °C to inactivate complement before use |
TrypLE | GIBCO | 12605 | http://www.lifetechnologies.com/ Cell dissociation solution |
Celigo cytometer | Nexcelom Bioscience | n/a | http://www.nexcelom.com Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative |
IX70 inverted microscope | Olympus | n/a | http://www.olympus.co.uk/ Used with camera for manual image capture |
Retiga Exi Fast 1394 digital camera | Qimaging | n/a | http://www.qimaging.com/ Attached to microscope for manual image capture |
Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Software used to control camera and microscope for manual image capture |
Image-Pro Analyzer 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size |
Excel 2010 | Microsoft | n/a | http://www.microsoft.com/ Scientific graphing and statistical software |
Prism 6.0 | GraphPad | n/a | http://www.graphpad.com/ Scientific graphing and statistical software |