三维（3D）肿瘤球体侵袭试验

1.代可重复大中球体瘤洗肿瘤细胞单层用磷酸盐缓冲盐水（PBS 5毫升的25cm 2或8 – 10毫升为一个75cm 2的烧瓶）中，加入细胞解离酶（1毫升的25cm 2或2毫升一75厘米2烧瓶），并孵育细胞，在37℃进行2 – 5分钟。 检查细胞脱离，在显微镜下，中和细胞解离酶与完全生长培养基中（5毫升的25cm 2或8毫升一75cm 2的烧瓶中）。 离心机细胞悬浮液在500×g离心5分钟。 去除上清液，挖掘管和1毫升完全培养基用吸管P1000重新悬浮细胞沉淀。这应该产生单细胞悬浮液没有细胞簇。 计数使用血球细胞和稀释的细胞悬浮液，以获得0.5 – 2×10 4个细胞/ ml（最佳细胞密度需要为在邻每个细胞系确定经过细胞种植12,13500μm的直径为4天） -的rDer获得300肿瘤球体。 细胞悬液转移到无菌的贮存器，并使用多通道移液管，取200μl/孔到超低附件（ULA）96孔圆底板12。 传送板向恒温箱（37℃，5％CO 2，95％湿度）。四天后，目视确认肿瘤球体的形成，并继续与3D侵袭实验。 2. 3D球体肿瘤侵袭试验 BMM解冻冰。 保持一组无菌过滤嘴为P10，P200和P1000移液器和无菌试管（1.5毫升体积，或者根据所需的总体积在较大的）在-20℃下。 上放置装有冰4天龄的球状体的ULA 96孔板中。 使用多道移液器，轻轻地从球体板除去生长培养基的100μl/孔。对于这一步的角度对我的提示nside壁在U形底的，避免了与井和球状体的位置的底部接触;尽量减少球体的干扰。 用冰冷的技巧，转移到BMM冰冷的管子。细胞因子诱导的入侵或药物评价研究，添加试剂（以2x终浓度）用冰冷的提示BMM。例如，使用表皮生长因子（EGF）刺激侵袭的CAL S和CAL – [R鳞癌细胞。纷飞轻轻，避免泡沫的形成拌匀。 轻轻免除100微升BMM进入U型底部的孔，瞄准尖端朝向井的内壁。这个步骤是最关键的，以获得最佳的图像分析，球状体必须保持在阱12的中心。 6重复/条件 – 为所有需要的井，让5重复步骤2.6。如果必要的话，切换到一个新鲜冷冻的提示。 注意：当更多的经验，DISPENSE BMM使用多道移液器。 用消毒针头，除去气泡，如果存在的话。 使用显微镜，目视检查球状体是在中心位置。如果不是这样，离心板在300×g离心3分钟，在4℃。这将确保球体居中位于每个孔中。 所述板转移到孵化器在37℃，并允许BMM固化。 1小时后，使用多道移液器，轻轻地加入100微升/完全生长培养基的好。对细胞因子诱导的侵袭或药物评价研究，包括在培养基中的细胞因子或抑制剂（1倍最终浓度）。替代地，如果试剂没有添加到BMM在步骤2.5中，将它们添加到所述介质在该点（3倍的所需最终浓度）。 3.自动图像采集扫描板的流式细胞仪（用于规格见表设备和材料 ）每隔STA从时间rting零（T0 =成立的侵袭测定当天，对步骤2.10到72小时，或96小时为较慢侵入肿瘤细胞系后立即使用。 选择“ 合流”的应用程序。 检查球体是重点，如果需要，手动调节和固定的“ 焦点抵销”。 在“ 采样设置 ”，选择要扫描的视图（FOV）一个中心领域。以下BMM此外，肿瘤球状体应该保持在中心位置，因此，就没有必要扫描整个井。 在软件中，限定孔以通过突出显示它们在板地图上进行扫描。点击“ 开始扫描 ”。 注：扫描自动保存，可以在以后离线审查。 4.自动图像分析选择“ 合流”的应用程序。 在“分析 ”选项卡，调整应用程通货膨胀设置（ 例如 ，“精确”：低，正常，高;“强度阈值”：1 – 15），以产生围绕球体精确分割，包括细胞过程和侵袭伪足伸入BMM（ 见图1）。调整每一个肿瘤细胞系和/或在不同时间点的设置。在“ 合流”的应用措施的井区覆盖的侵入细胞，在选择FOV的％。 检查分析设置适当（ 即分割是准确的），在其他板块球体通过点击几个不同的井。如果分割不能准确地勾勒出一个球体，进一步调整应用程序设置。 点击“ 开始分析 ”。 在“结果 ”选项卡，选中多口井，以验证质量分析。导出“嗯级数据'到电子表格程序。 Repea吨分析的所有时间点。计算平均值％汇合的重复井和情节入侵（％汇合）与时间的柱状图，用科学的图形和选择的统计软件。 5.手动图像采集记录每个肿瘤球体的图像的时间间隔开始从t = 0到72 – 96小时，这取决于侵袭的细胞系中的问题，使用倒置显微镜（对于96孔板这需要约20的速度 – 30分钟）。用10倍的目标。使用4X物镜时侵入面积过大，无法完全视10X字段内捕获。 保存获得的每一个人形象。 为校准，同时使用10X和4X目标采取的一个阶段刻度（1毫米）的图像（和保存图像）。 6.手动图像分析打开阶段刻度图像转换成所选择的图像分析软件。 进入GRATicule测量，单位（μm）时，目标使用（10X或4X）和执行校准。此步骤是必需的仅一次。对于后续的图像分析，只需重新加载所需的校准设置。 打开侵袭测定图像和选择取决于显微镜物镜（10X或4X）校准设置用于获得图像。 可替代地，获得的进口上的图像的成像仪（步骤3）和手动分析，如对于使用倒置显微镜获得的图像（参见图3和图4中所示的结果）。 测量所覆盖球体的区域。 在这里使用的代表性结果（规格见表设备和材料）的软件，进入“测量”，然后选择“计数/大小”。选择“文件”，然后“加载设置”，然后选择预先确定的ASSAÿ设置。然后选择“计数”。球体然后应准确分割。 或者去“编辑”，然后“绘制/合并对象”，打开“魔术棒/跟踪”窗口。使用棒光标点击球体图像上，并获得分割。选择“跟踪”（在“ 魔棒”窗口）使用鼠标手工勾勒球体。 不同的参数（面积，直径，周长等 ）的电子表格导出测量。在电子表格记录的图像信息（ 例如 ，井数，相对时间点）。 重复绘制球体（入侵）与时间用科学的图表和统计软件的平均面积。可替代地，计算在每个时间点在球体区域中的变化，相对于在t面积= 0。然后情节入侵（％T0）与时间的关系为线性硅胶制作pH值。