3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석
Summary
Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.
Abstract
종양 (양성 대조적으로) 정상 조직 주변의 내습 일반적 악성의 주요 특징 인 것으로 간주된다. 특히 일부 암 (. 예, 예컨대 아교 모세포종 홍반과 헤드의 편평 상피 세포 암 및 목 등 뇌종양 – SCCHN) 그것은 심각한 이환율의 원인과 생명을 위협하는 원격 전이의 부재 하에서조차 할 수있다. 또한, 재발 한 암은 불행하게도 종종 존재하는보다 적극적인 표현형과 치료를 다음과 같습니다. 따라서, 표준 항 – 증식 제제 상보 수 신규 치료법을 제공하는 침입 과정을 표적으로 할 수있는 기회가있다. 지금까지,이 전략은 침략에 대한 자세한 분석 및 약물 검사에 적합한 강력한 재현 분석의 부족에 의해 방해되었다. 여기에 우리가 간단한 마이크로 플레이트 방법을 제공 (유니폼을 기반으로, 자기 조립 3D 종양 회전 타원체)를 같은 STU에 대한 큰 잠재력을 가지고죽는다. 또한 인간 아교 모세포종 세포주 및 대상 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 억제제에 대해 내성이 강화 매트릭스 개발 침습 전위와 연관된 SCCHN 모델을 이용하여 분석 플랫폼을 예시한다. 사이토 이미지를 사용하여 하나 단순히 디지털 이미지 분석과 표준 현미경 및 이미지 캡처를 요구하는 두 번째 : 우리는 또한 반자동 정량의 두 가지 다른 방법을 제공합니다.
Introduction
고전 항암제 개발은 종양 세포 증식을 억제 및 / 또는 프로그램 된 세포 사멸 (아폽토시스)를 촉진 세포 독성 제에 대한 스크린 시험 관내 세포 – 기반 분석의 사용에 주로 집중된다. 최근의 노력은 악성 세포 증식의 근본적인 원인 분자 억제제의 개발 치료 표적을 향해 이동했다. 일부 극적인 결과에도 불구하고, 이러한 제제는 종종 약물 내성의 급속한 발전과 관련된다. 이 암 사망의 대부분을 담당하는 종양 세포의 침윤과 전이의 가능성이 있으며, 그 재발 질병은 종종 그것이 시험 관내 실험 모델 소설을 식별 1,2 상보 고려하는 것이 논리적이다 공격적인 표현형을 나타낸다 감안할 암의 이러한 추가 키 '특징'을 억제하는 것입니다 요원.
악성 진행하는 동안 종양 세포 취득주변 조직을 침범 및 / 또는 원격 장기 (전이)로 확산 할 수있는 능력. 암세포는 3,4- invadopodia의 형성에 의해 기저막을 뚫고. 이러한 구조는 액틴 필라멘트, 특정 접착 단백질 및 단백질 분해 효소로 통칭하고 농축 종양 세포 운동성 및 세포 외 기질 (ECM) (5)의 저하에 대한 책임이있다. Invadopodia는 ECM 내로 연장하고, 종양 세포의 침윤을위한 중요하고 또한 혈행 (또는 림프계) 보급과 전이를 촉진, 혈관 외 유출 채널로 여겨진다.
현재 표준 방법은 다음과 같다 시험 관내 종양 세포의 침윤을 평가. 트랜스 웰 기반 또는 보이든 챔버 분석법 단일 세포 현탁액은 ECM 유래 단백질의 두꺼운 층으로 코팅 된 필터의 상부에 시딩 2,6-. 세포는 침입 항암 화학 유인 물질에 반응하여 하부 챔버로 이동한다. 일반적으로 사용되는 전자 재료단백질은 내가 콜라겐 타입, 또는 기저막의 자연 성분을 모방 (EHS 종양 (7)에서 파생 된 BMM, 예를 들어, 마트 리겔) 기저막 같은 행렬.
필터 기반 보이 덴 챔버 형 분석법 (8)에 대한 대안으로서, 셀은 겔 내로 침입 개별적으로 또는 집합 적으로 다음 단층과 형성 (섬유 아세포 첨가 수도있는) ECM 겔 위에 시드 할 수있다. 침윤 겔 표면 (9)로부터 침입하는 세포 이동 및 / 또는 거리의 개수로 측정 될 수있다. 일반적으로 세포가 주위 매트릭스 2,6,10,11로 종양 덩어리에서 침입하게 ECM의 겔의 두 층 사이에 위치 – 종양 세포는 완전 매트릭스로 어느 하나의 세포 현탁액 또는 타원체로 내장 될 수있다.
여기에 설명 된 3 차원 (3D) 타원체 종양 침윤 분석은 highl를 사용하여 신속하고 내습 오토메이션 시스템을 제공한다웰 당 하나의 회전 타원체와 96- 웰 플레이트 형식으로 재현 Y, 표준화 된 방법 (12). BMM은 종양 세포가 구형 본체로부터 침입되는 반 고형 매트릭스를 제공하기 위해 각 웰에 직접 첨가된다. 96 시간 – 종양 세포 침윤의 정도는 72 시간에 걸쳐 간격으로 모니터링된다. 이 방법은 상기 언급 한 현재 관내 침윤 분석에 비해 다음과 같은 장점을 제공한다 : 세포를 종양 미세 영역 또는 미세 전이를 흉내 낸 3 차원 구조로 구성되어 종양; 종양의 크기는 회전 타원체 높은 재현성; 침입 분석은 보조 플레이트로 이동할 필요없이 종양 타원체 개발 같은 플레이트에서 반응계에서 수행된다; 자동화 된 이미지 분석의 최신 기술과 결합 방법은, 모두 높은 컨텐츠를 가능하게하고 높은 처리량은 종양 세포 침윤 분석.
이미지 분석은 96 웰 세포 계측기를 스캔 촬상을 이용하여 수행된다10 분 이내 판. 합류 응용 프로그램을 사용하여, 어느 정도의 비율과 내습 단일 세포 또는 세포 클러스터 종양 타원체에서 밖으로 확산 및 동적 방식으로 측정 될 수 매트릭스 내로 침입하거나하여 달성했다. 낮은 처리량 들어, 이미지 분석을위한 다른 방법은 반전 된 현미경 및 이미징 소프트웨어 표준의 사용에 기초하여 제시된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 두 종양 모델 (아교 모세포종과 SCCHN)을 구체적으로 그들이 임상 적으로 효과적인 치료 (12)에 대한 충족되지 않은 요구와 관련 로컬 침습적 암이기 때문에 우리의 3D 분석을 예시하기 위해 선택되었다. 약물 치료 시험 관내 약물 역학 (PD) 바이오 마커의 변화 평가 BMM 및 / 또는 전체가 종양 타원체 침입의 면역 분석에서 세포의 회복을 허용하기 위해 특정 시판되는 시약을 사용 다음 웨스턴 블롯 또는 용 해물의 면역 분석에 의해 용이하게 행할 수 이어 마운트 염색.
이 침공 분석은 유용한 반고체 매체에 종양 세포 침공의 신속하고 재현성 평가를위한 기술 및 생체 외 약물 검사에서 미래에 대한 때문에 특히 적합하다. 암 세포들은 종양 타원체로 표시되는 "미세 종양"에서 확산로 3D 방식으로 매트릭스에 침입하고 extracellul 내로 연장AR 매트릭스 같은 환경. 분석의 진정한 입체감이 고체 기판에 세포가 이동할 때 가정 평평한 부착 형태와 다른 세포 형태에 분명하다. 침윤 정도를 쉽게 또는 이미징 소프트웨어와 조합 표준 현미경을 사용하여 자동 판독을 허용 사이토 이미징을 사용하여 정량된다. 또한,이 방법은 적합 형광 이미징 13 (형광 단백질이나 발현 세포주와 예를 들어, 형광 염료로 미리 라벨링).
에서 회전 타원체의 중심 위치 교란의 위험이있는 경우에있어서 BMM의 첨가에 의해 표시되는 경우에만 중요 단계를 수행하는 간단 웰 U 자형. 이것은 서로 다른 초점면에 회전 타원체로, 최적 이미지 분석 될 수 있습니다. 그것은 각 웰에 조심스럽게 천천히 BMM을 추가하는 것이 중요하다. BMM 추가 후에는 판을 확인하는 것이 좋습니다현지화가 받아 들일 수없는 것으로 간주되는 경우 현미경과,이는 부드러운 원심 분리에 의해 해결 될 수 있습니다. 경험을 바탕으로,이 거의 필요하다. 이 방법은 강력하고 매우 재현하는 동안, 간 실험적인 변화는 BMM의 다른 배치로 발생할 수 있습니다. 이를 방지하기 위해, 일련의 연구를 수행하는 하나의 배치에서 충분한 BMM을 구입하는 것이 바람직하다.
방법의 제한은 (이러한 분석 용 등)의 종양 세포 가능성 분석 기간 동안 겪게 침윤 및 증식을 구별하는 어려움이다. 세포의 배가 시간이 고려, 또는 사이토 칼라 신 D와 같은 세포주기 억제제가 도입 될 수 있지만, 제어하거나 명확 특히 빠르게 성장하는 종양 세포에 대한 이들에 대해, 종양 진행의 두 가지 측면을 구별하기 쉽지 않다 더 "광대"보다는 침윤성, 침입 패턴을 가지고있다. 이 때문에그것은 평행 차원 성장 분석은 어떤 자극 또는 억제 제제의 특정 효과를 평가하기 위해 수행되는 것을 제안한다. 주의 투여 량 반응 연구를 수행한다면, 그 증식에 미치는 영향을 최소화 농도를 선택하는 것이 가능할 수있다. 예를 들어 우리는 HSP90 17-AAG가 50 % (GI 50) (12)에 의해 3D 성장을 억제 24 시간에서와 농도 이하 농도에서 이미 U-87 MG 3D 종양 회전 타원체의 침략을 억제하는 억제제 것으로 나타났습니다.
한편, 상기 분석의 중요성은 다른 표준 침윤 분석 (예를 들어, 필터 기반 분석법 또는 3D 매트릭스 (1)에 단일 세포 침윤)에 비해 종양 세포가 유사한 것을 타원체로부터 주변 매트릭스 내로 침입한다는 것이다 " 따라서 마이크로 종양 "또는"미세 전이 ", 및 종양 덩어리의 병태 생리의 계정 중요한 측면을 고려합니다. 우리가 제시하는 방법은에 대한 정보를 제공합니다처음 타원체를 떠나, 또한 개별적으로, 하나의 셀에 BMM 더 먼 영역에 도달하면 종양 세포의 집단 행동. 또한, 종양 회전 타원체 내 세포는 저산소증과 영양 부족을 경험할 수있는, 유전자 발현의 변화를 통해, 마이그레이션 및 침략을 홍보 할 수 있습니다; 이러한 기능은 2D 분석에 존재하지 않는다. 또한,이 모두는보다 복잡한 3 차원 분석을 용이하게 목표 검증 및 약물 개발에 사용될 수 있도록, 특정 96- 웰 플레이트의 사용을 통해 높은 처리량 형식과 최신 촬영 기술에 사용 가능하다.
우리가 제시 방법은 종양 세포의 침윤 추가적인 양태를 해결하는 또 다른 애플리케이션을 수용 할 수있다. 특히, 여분의 복잡성은 회전 타원체 자체 또는 주변 행렬로, 이러한 섬유 아세포 및 / 또는 내피 세포와 같은 숙주 세포의 첨가에 의해 예상 될 수있다. 이것은 또한 강성의 관점에서 (다른 공동의 사용에 의해서도 수정 될 수있다BMM의 ncentrations)뿐만 아니라, 조성물의 관점에서 (채택 종양 모델의 특정 조직 / 기관에 의존하는 다른 구성 요소의 추가에 의해 : 유방 암종 17)에 대한 뇌 암 (16) 및 콜라겐 등, 테네 스틴.
(회전 타원체 및 이미징의 세대)와 유사한 셋업은 종양 회전 타원체가 다른 세포 특이 organoids (예 :, 성상 세포와 복잡한 조직 (12)를 닮은 배아 체와 공동 배양 차원에서 조직 침공을 평가하기 위해 적용 할 수 있습니다 신경 교종 18 토굴 위장 암에 대한 문화)하지만 추가 작업은 자동화 된 이미지 분석을 사용하는 데 필요합니다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Web address |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | http://www.corning.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
| Cultrex Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3432-005-01 | http://www.trevigen.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
| Ultra-low attachment 96-well plate | Corning | 7007 | http://www.corning.com |
| EGF | Miltenyi Biotec | 130-093-825 | http://www.miltenyibiotec.com Add 100 µl 1% BSA (w/v) in water to 100 µg EGF. To 25 µl of this, add 4,975 µl RHB-A medium to give a 10 µg/ml working stock. Aliquot and store at -20ºC |
| RHB-A medium | Stem Cells Inc. | SCS-SF-NB-01 | http://www.stemcellsinc.com For diluting EGF |
| DMEM | GIBCO | 31966-021 | http://www.lifetechnologies.com/ Warm in 37 °C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | Biosera | 1001/500 | http://www.biosera.com Heat at 56 °C to inactivate complement before use |
| TrypLE | GIBCO | 12605 | http://www.lifetechnologies.com/ Cell dissociation solution |
| Celigo cytometer | Nexcelom Bioscience | n/a | http://www.nexcelom.com Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative |
| IX70 inverted microscope | Olympus | n/a | http://www.olympus.co.uk/ Used with camera for manual image capture |
| Retiga Exi Fast 1394 digital camera | Qimaging | n/a | http://www.qimaging.com/ Attached to microscope for manual image capture |
| Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Software used to control camera and microscope for manual image capture |
| Image-Pro Analyzer 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size |
| Excel 2010 | Microsoft | n/a | http://www.microsoft.com/ Scientific graphing and statistical software |
| Prism 6.0 | GraphPad | n/a | http://www.graphpad.com/ Scientific graphing and statistical software |
References
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