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Médecine

Tridimensionnelle (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Published: May 01, 2015
doi:
10.3791/52686
, ,
1Division of Molecular Pathology,The Institute of Cancer Research, 2Division of Cancer Therapeutics,The Institute of Cancer Research

Summary

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Abstract

L'invasion des tissus normaux environnants est généralement considéré comme une caractéristique clé de maligne (par opposition à des tumeurs bénignes). Pour certains cancers, en particulier (par exemple, les tumeurs cérébrales telles que glioblastome multiforme et le carcinome spinocellulaire de la tête et du cou -. SCCHN), il est une cause de morbidité grave et peut être mortelle, même en l'absence de métastases à distance. En outre, les cancers qui ont rechuté après un traitement malheureusement souvent présent avec un phénotype plus agressif. Par conséquent, il est possible de cibler le processus d'invasion de fournir de nouvelles thérapies qui peuvent être complémentaires à des agents anti-prolifératifs standard. Jusqu'à présent, cette stratégie a été entravée par le manque de tests robustes, reproductibles appropriés pour une analyse détaillée de l'invasion et de dépistage de drogue. Ici nous fournissons une méthode micro-plaque simple (basé sur uniforme, auto-assemblage sphéroïdes tumoraux 3D), qui a un grand potentiel pour une telle stumeurt. Nous illustrons la plate-forme de test utilisant une lignée cellulaire de glioblastome humain et également un modèle SCCHN où le développement de la résistance contre le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR ciblé inhibiteurs) est associée à un potentiel de matrice renforcée invasive. Nous fournissons également des deux autres méthodes de quantification semi-automatique: une en utilisant une imagerie cytomètre et un deuxième qui exige simplement la capture de microscopie et de l'image standard avec analyse d'image numérique.

Introduction

Classique développement de médicaments anticancéreux est largement axé sur l'utilisation des essais in vitro à base de cellules à l'écran pour les agents cytotoxiques qui inhibent la prolifération cellulaire tumorale et / ou favorisent la mort cellulaire programmée (apoptose). Plus récemment, des efforts ont évolué vers des thérapies ciblées avec le développement d'inhibiteurs des causes moléculaires sous-jacents de la prolifération des cellules malignes. En dépit de quelques résultats spectaculaires, ces agents sont souvent associés avec le développement rapide de la résistance aux médicaments. Étant donné qu'il est le potentiel invasif et métastatique des cellules tumorales qui est responsable de la majorité des décès par cancer, maladie récidivante et qui présente souvent un phénotype plus agressif, il est logique de considérer également complémentaire dans des modèles expérimentaux in vitro pour identifier de nouvelles 1,2 agents qui inhibent ces «caractéristiques» clés supplémentaires de cancer.

Au cours de la progression maligne, les cellules tumorales acquièrentla capacité d'envahir les tissus environnants et / ou la propagation dans des organes distants (métastases). Les cellules cancéreuses pénètrent dans la membrane basale par la formation de invadopodia 3,4. Ces structures sont enrichies avec des filaments d'actine, des protéines d'adhérence et de proteinases spécifiques et sont collectivement responsables de la motilité des cellules tumorales et de la dégradation de la matrice extracellulaire (ECM) 5. Invadopodia étendre dans l'ECM et sont jugées importantes pour l'invasion des cellules de la tumeur et une extravasation également dans les canaux vasculaires, facilitant hématogène (ou lymphatique) la diffusion et la métastase.

Méthodes standards actuelles pour évaluer l'invasion des cellules tumorales in vitro comprennent ce qui suit. Transwell base d'essais ou de la chambre de Boyden 2,6 où suspensions de cellules isolées sont ensemencées sur un filtre revêtu d'une épaisse couche de protéines de la MEC dérivés. Cellules envahissent ensuite et se déplacent dans la chambre inférieure en réponse à une chimio-attractif. Communément utilisé ECMles protéines sont collagène de type I, ou une membrane analogue à matrice de sous-sol (BMM, par exemple, de Matrigel, dérivé de la tumeur EHS 7) qui imite la composition naturelle de membranes basales.

Comme une alternative aux essais de type chambre Boyden à filtre 8, les cellules peuvent être ensemencées sur le dessus d'un gel d'ECM (à laquelle peuvent être ajoutés des fibroblastes), où ils forment une monocouche et ensuite envahir individuellement ou collectivement dans le gel. Invasion peut être mesurée en termes de nombre de cellules et / ou de la distance envahisseurs venus de la surface du gel 9. Les cellules tumorales peuvent également être entièrement noyées dans une matrice soit sous forme de suspension de cellules individuelles ou sous forme de sphéroïdes – habituellement placées entre deux couches de gel-ECM permettant d'envahir les cellules de la masse tumorale dans la matrice environnante 2,6,10,11.

Les trois dimensions (3D) sphéroïde de tumeur dosage d'invasion décrite ici fournit un système d'invasion rapide, automatisable utilisant un highly reproductible, méthode standardisée 12 dans un format de plaque de 96 puits avec un sphéroïde par puits. BMM est ajouté directement à chaque puits pour donner une matrice semi-solide dans laquelle les cellules tumorales envahissent du corps sphéroïde. L'étendue de l'invasion des cellules tumorales est surveillé à des intervalles sur une période de 72-96 heures. Cette méthode présente les avantages suivants au cours des essais in vitro courants d'invasion mentionnés ci-dessus: la tumeur des cellules sont organisées en une structure 3D imitant une micro-région de la tumeur ou une micro-métastase; les sphéroïdes tumoraux sont hautement reproductibles en taille; le dosage d'invasion est réalisée in situ dans la même plaque que le développement de sphéroïde de tumeur, sans qu'il soit nécessaire de les déplacer à des plaques secondaires; la méthode, combinée avec les dernières technologies de l'analyse automatique de l'image, permet à la fois de haute teneur et analyse à haut débit de l'invasion des cellules tumorales.

L'analyse d'image est réalisée en utilisant un cytomètre imagerie, qui balaye un 96 puitsplaque dans les 10 minutes. En utilisant l'application de confluence, l'étendue et le taux d'invasion atteints soit par des cellules individuelles ou par des amas de cellules étendent depuis les sphéroïdes de tumeur et invasion dans la matrice peut être mesurée de façon dynamique. Pour un débit plus faible, un autre procédé pour l'analyse d'images est présentée, sur la base de l'utilisation d'un microscope inversé et un logiciel d'imagerie standard.

Protocol

1. Génération de reproductible Sphéroïdes tumorales Sized Laver les monocouches de cellules tumorales avec un tampon phosphate salin (PBS, 5 ml d'une 25 cm 2 ou 8 à 10 ml pour un 2 flacon de 75 cm), ajouter dissociation cellulaire enzymatique (1 ml pour 25 cm 2 ou 2 ml d'une 75 cm 2 fiole) et on incube les cellules à 37 ° C pendant 2-5 min. Vérifier le détachement des cellules au microscope et neutraliser la dissociation enzymatique des cellules avec du milieu de croissance complet (5 ml pour une 25 cm 2 ou 8 ml pour un flacon de 2 75 cm). Centrifugeuse suspension de cellules à 500 g pendant 5 min. Retirer le surnageant, tapoter le tube et remettre en suspension culot cellulaire dans 1 ml de milieu de croissance complet en utilisant une pipette P1000. Cela devrait donner une suspension de cellule unique sans amas de cellules. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre et on dilue la suspension de cellules pour obtenir de 0,5 à 2 x 10 4 cellules / ml (densité cellulaire optimale doit être déterminée pour chaque lignée cellulaire en order pour obtenir des sphéroïdes tumoraux de 300 à 500 um diamètre de 4 jours après l'ensemencement cellulaire 12,13). Transférer la suspension cellulaire à un réservoir stérile et, à l'aide d'une pipette multicanaux, distribuer 200 pl / puits dans ultra-faible attachement (ULA) plaques à 96 puits à fond rond 12. Transférer les plaques dans un incubateur (37 ° C, 5% de CO2, 95% d'humidité). Quatre jours plus tard, confirmer visuellement la formation sphéroïde de la tumeur et de procéder à l'essai d'invasion 3D. 2. 3D tumeur Spheroid Invasion Assay Décongeler BMM sur la glace. Gardez un ensemble de bouts filtres stériles pour P10, P200 et P1000 pipettes et tubes stériles (1,5 ml de volume ou plus en fonction du volume total requis) à -20 ° C. Placez les ULA plaques à 96 puits contenant âgées de 4 jours sphéroïdes sur la glace. En utilisant une pipette multicanaux, retirez délicatement 100 pl / puits de milieu de croissance à partir des plaques de sphéroïde. Pour cette angle de pas les conseils vers le inside paroi des puits à fond en U, en évitant tout contact avec le fond du puits et l'emplacement des sphéroïdes; minimiser la perturbation des sphéroïdes. En utilisant des pointes glacées, transférer BMM à tubes glacés. Pour invasion induite par les cytokines ou pour des études d'évaluation des médicaments, ajoutera des réactifs (à 2x la concentration finale) à l'aide de conseils BMM glacées. Par exemple, utiliser le facteur de croissance épidermique (EGF) pour stimuler l'invasion des cellules de carcinome épidermoïde CAL S et R CAL. Bien mélanger en agitant doucement, en évitant la formation de bulles. Passer doucement 100 pi de BMM dans le puits à fond en U, visant la pointe vers la paroi intérieure du puits. Cette étape est la plus critique que, par analyse d'image optimale, des sphéroïdes doivent rester dans le centre du puits 12. Répétez l'étape 2.6 pour tous les puits nécessaires, permettant 5-6 répétitions / état. Si nécessaire, changez à une pointe fraîchement réfrigérés. REMARQUE: Lorsque plus expérimenté, DISPENBMM soi à l'aide d'une pipette multicanaux. Utiliser une aiguille stérile, enlever les bulles, si elle est présente. En utilisant un microscope, vérifier visuellement que sphéroïdes sont dans une position centrale. Si non, centrifuger la plaque à 300 g pendant 3 min à 4 ° C. Cela permettra d'assurer que les sphéroïdes sont situés au centre de chaque puits. Transférer la plaque dans un incubateur à 37 ° C et laisser se solidifier le BMM. 1 h plus tard, à l'aide d'une pipette multicanaux, ajouter doucement 100 ul / puits de milieu de croissance complet. Pour invasion ou d'évaluation des médicaments études induite par des cytokines, inclure des cytokines ou des inhibiteurs dans le milieu (1x concentration finale). Alternativement, si les réactifs ne sont pas ajoutés à la BMM à l'étape 2.5, ajoutez-les au milieu à ce point (3x la concentration finale souhaitée). 3. automatisé Image Acquisition Plaques de numérisation sur le cytomètre (pour spécifications, voir le tableau de l'équipement et des matériaux) à intervalles starter de temps zéro (t0 = jour de l'essai d'invasion mis en place, immédiatement après l'étape 2.10 jusqu'à 72 h ou 96 h pour les lignes d'invasion de cellules tumorales plus lents. Sélectionnez l'application «Confluence». Vérifiez que le sphéroïde est au point et, si nécessaire, régler et modifier manuellement le «Focus off-set». Sous la rubrique «paramètres échantillonnage», sélectionnez pour balayer une zone centrale de vision (FOV). Après l'addition BMM, sphéroïdes tumoraux auraient dû rester dans une position centrale, il n'y a donc pas besoin de balayer l'ensemble bien. Dans le logiciel, définissent les puits pour être numérisés en les sélectionnant sur la carte de la plaque. Cliquez sur "Lancer la numérisation '. REMARQUE: La numérisation est automatiquement sauvegardé et peut être revue ultérieurement hors ligne. 4. Analyse d'image automatisé Sélectionnez l'application «Confluence». Dans l'onglet 'Analyse de, ajuster applicparamètres de ation (par exemple, «précision»: bas haut, normal,; "seuil d'intensité": 1 – 15) pour produire une segmentation précise autour de la sphéroïde, y compris les processus cellulaires et invadopodia étendant dans le BMM (voir Figure 1). Régler les paramètres de chaque lignée de cellules de tumeur et / ou à différents points dans le temps. Mesures d'application de la «Confluence» de l'% de la superficie de bien couverts par les cellules envahissantes, dans le FOV sélectionné. Vérifiez que les paramètres d'analyse sont appropriées (par exemple, la segmentation est exacte) pour les autres sphéroïdes dans la plaque en cliquant sur ​​quelques puits différents. Si la segmentation ne précise pas exactement un sphéroïde, ajuster les paramètres de l'application plus loin. Cliquez sur "Lancer l'analyse". Dans l'onglet "Résultats", vérifier plusieurs puits pour vérifier la qualité de l'analyse. Export 'Eh bien les données de niveau »à un tableur. REPEAanalyse de t pour tous les points dans le temps. Calculer la moyenne% de confluence pour les puits répétés et l'invasion de la parcelle (% de confluence) contre le temps dans un graphique à barres, à l'aide de graphiques scientifique et logiciel statistique de choix. 5. Acquisition manuel de l'image Enregistrer une image pour chaque sphéroïde de tumeur à des intervalles à partir de t = 0 jusqu'à 72 à 96 heures, en fonction de la vitesse de l'invasion de la lignée cellulaire en question, en utilisant un microscope inversé (pour une plaque de 96 puits cela prend environ 20 – 30 min). Utilisez un objectif 10X. Utilisez un objectif 4X quand une zone envahie est trop grande pour être complètement capturé dans le champ 10X de vue. Enregistrer chaque image acquise. Pour l'étalonnage, prendre des images d'un réticule de l'étape (1 mm) en utilisant les deux objectifs 10X et 4X (et enregistrer des images). 6. Manuel Analyse d'Image Ouvrez les images du réticule de la scène dans le logiciel d'analyse d'image de votre choix. Entrez le gratmesures icule, les unités (um), les objectifs utilisés (10X ou 4X) et d'effectuer l'étalonnage. Cette étape est nécessaire qu'une seule fois. Pour l'analyse de l'image suivante, rechargez simplement les paramètres de calibrage requis. Ouvrez les images de dosage d'invasion et sélectionnez les paramètres d'étalonnage en fonction de l'objectif du microscope (10X ou 4X) utilisé pour obtenir les images. Alternativement, importer des images obtenues sur un cytomètre imagerie (étape 3) et d'analyser manuellement, comme décrit pour les images obtenues à l'aide d'un microscope inversé (voir résultats de la figure 3 et la figure 4). Mesurer la zone couverte par les sphéroïdes. Dans le logiciel utilisé ici pour les résultats représentatifs (pour spécifications, voir le tableau de l'équipement et des matériaux), aller à «Mesure» et sélectionnez «comte / size '. Choisissez «Fichier» puis «Charger les paramètres 'et sélectionnez pré-déterminée assaparamètres y. Ensuite, choisissez "Count". Le sphéroïde devrait alors être segmenté avec précision. Sinon aller à "Modifier", puis "Dessiner / fusionner des objets 'pour ouvrir la fenêtre" Magic Wand / Trace ". Utilisez le curseur de la baguette de cliquer sur l'image sphéroïde et d'obtenir la segmentation. Sélectionnez 'Trace' (dans la fenêtre 'Magic Wand ") pour décrire manuellement le sphéroïde aide d'une souris. les mesures à l'exportation de différents paramètres (surface, diamètre, le périmètre etc.) à une feuille de calcul. Enregistrer sur la feuille de calcul des informations d'image pertinente (par exemple, nombre bien, point de temps relatif). Tracer la surface moyenne de sphéroïdes répétées (de l'invasion) en fonction du temps à l'aide de graphiques scientifiques et des logiciels statistiques. Alternativement, calculer la variation dans la zone sphéroïde à chaque point de temps, par rapport à la zone à t = 0. Alors invasion de la parcelle (% t0) en fonction du temps comme un gra linéaireph.

Representative Results

3D sphéroïde invasion tumorale est évaluée en utilisant un reproductible, procédé simple, automatisé illustré schématiquement sur ​​la figure 1: sphéroïdes de tumeur de taille reproductible sont obtenus par étalement des cellules dans ULA plaques à 96 puits à fond rond. 4 jours post-initiation sphéroïdes sont intégrés dans BMM. Ceci permet d'obtenir une structure semi-solide dans laquelle les cellules tumorales envahissent et répartis de la sphéroïde. Sphéroïdes sont situés au centre à la base de chaque puits et l'invasion dans le BMM est aisément contrôlée à intervalles à partir de t = 0 jusqu'à 72 à 96 h en utilisant une imagerie cytomètre. Cela peut fournir entièrement automatisé d'analyse d'image. Des exemples de différents types d'invasion des cellules cancéreuses sont illustrés sur les figures 2 -. 4 Le glioblastome multiforme humain (GBM) lignée de cellules hautement malignes U-87 MG, forme une structure en 3D étanche, de forme sphérique et est utilisée ici pour illustrer des tumeurs du cerveau dans lesquelles locale invasion est une clé mortellefonctionnalité. Une fois incorporé dans BMM, les cellules de sphéroïdes U-87 MG, réparties avec un modèle d'invasion "starburst" typique 12. Les cellules tumorales étendent radialement dans la matrice dans laquelle elles maintiennent une forme à 3 dimensions. Le procédé est suivi sur une période de 72 heures comme représenté sur la Figure 2 pour U-87 MG, des sphéroïdes, lors de la mesure de l'invasion de cellules tumorales, avec des détails sur les processus cellulaires et se prolongeant dans la invadopodia BMM est clairement évidente. Analyse d'image en utilisant un cytomètre d'image permet la quantification précise de l'invasion des cellules tumorales au fil du temps entièrement automatisé. La quantification de la figure 2 est obtenu comme illustré sur la figure 1, où l'analyse automatisée segmentation produit autour des saillies pénétrant dans la cellule de la BMM U-87 MG corps sphéroïde. A noter que pour cette lignée cellulaire, le corps de sphéroïde de tumeur est exclu de la mesure de la zone envahie. Un modèle différent de invasion est affichée par des lignes squameuses humaines de cellules cancéreuses de la tête et du cou. CAL S et R sont CAL isogène, mais CAL S est sensible à, et CAL R résistants aux inhibiteurs de la tyrosine kinase EGFR 14. En l'absence d'EGF, ni lignée cellulaire a envahi dans la BMM (Figure 3) Toutefois, comme la concentration de EGF a été augmentée (à 2,5 ng / ml), les sphéroïdes semblent «bud». Aux concentrations plus élevées de l'EGF (40 et 80 ng / ml) le degré d'invasion a été réduite. Ceci est cohérent avec la réponse à la dose classique en forme de cloche à l'EGF en termes d'invasion qui a été précédemment rapporté 15. Dans 20 ng / ml d'EGF, saillies en forme de doigts extrudées à partir du corps principal de sphéroïdes CAL R tandis que les cellules CAL S étaient moins invasive après 72 h (Figure 3). Cette invasion différentielle était évidente 48 heures après sphéroïdes ont été placés dans BMM (contenant 20 ng / ml d'EGF de distinction maximal entre des lignes de cellules) Et le plus grand après 72 h (Figure 4). Ces images ont été acquises rapidement à l'aide d'un cytomètre imagerie, comme pour U-87 MG. Cependant, dans ce cas, pour illustrer un autre procédé, le degré d'invasion a été quantifiée manuellement en utilisant un logiciel d'analyse d'image autonome et est présentée sous forme graphique (figures 3 et 4). Ces résultats illustrent une différence phénotypique entre les cellules sensibles aux médicaments et résistantes qui pourraient être utilisés pour cribler des composés qui antagonisent spécifiquement le médicament résistant, phénotype invasif. Figure 1. Aperçu schématique de la 3D sphéroïde tumeur dosage d'invasion. Le flux de travail montre les étapes de la méthode consiste à inclure des images représentatives de sphéroïdes U-87 MG glioblastome juste après incorporation dans BMM (panneau supérieur; t = 0) et après l'invasion dans BMM (panneau de fond; t = 72 h) avec et sans la segmentation qui mesure la zone couverte par les cellules envahissantes. Bar = 100 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2. Le cours du temps invasion U-87 MG glioblastome sphéroïde dans BMM. U-87 MG sphéroïde invasion 3D dans BMM a été surveillée et quantifiée jusqu'à 72 heures en utilisant un cytomètre imagerie. (A) Des images représentatives et (B) la quantification des invasion des cellules tumorales sont indiquées. Bar = 500 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. re 3 "src =" / files / ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg "/> Figure 3. CAL R (résistant) et CAL S (sensible) invasion sphéroïde de la tumeur. (A) Des images représentatives et (B) la quantification manuel de l'EGF dose-dépendante CAL R et S CAL sphéroïde invasion tumorale sont présentés. Bar = 500 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4. Les cellules de CAL R (résistants) sphéroïdes sont plus invasive que S sphéroïdes tumoraux CAL (sensibles) lorsqu'il est placé dans BMM. Sur sphéroïdes tumorales EGF stimulation CAL R montrent une invasion plus prononcée que CAL S. (A) Des images représentatives et (B) la quantification manuel d'invasion sont représentés. Bar = 500 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Les deux modèles de tumeurs décrites ici (glioblastome et SCCHN) ont été spécifiquement choisis pour illustrer notre test de 3D ​​comme ils sont cliniquement cancers localement invasives pertinents ayant un besoin non satisfait de thérapies efficaces 12. Suite à un traitement médicamenteux, l'évaluation de vitro changements de pharmacodynamique (PD) de biomarqueurs peut être effectuée facilement par blot ou analyses immunologiques de lysats western suite à l'utilisation de réactifs disponibles dans le commerce spécifiques pour permettre la récupération des cellules à partir de BMM et / ou l'analyse par immunofluorescence de l'invasion des sphéroïdes de tumeur par toute coloration monture.

Cet essai d'invasion est une technique utile pour l'évaluation rapide et reproductible de l'invasion des cellules tumorales dans un milieu semi-solide et donc particulièrement approprié pour l'avenir dans le dépistage de la drogue vitro. Les cellules cancéreuses envahissent la matrice 3D d'une manière qui se propagent à partir d'un "micro-tumeur», représentée par le sphéroïde de tumeur, et se prolongent dans une extracellulenvironnement matriciel comme ar. Le vrai tridimensionnalité de l'essai est évident dans la morphologie cellulaire, qui est différente de la morphologie des cellules adhérentes plat supposent lors du déplacement sur un substrat solide. Le degré d'invasion est facilement quantifiée en utilisant soit un cytomètre de formation d'image, ce qui permet une lecture automatique, ou en utilisant un microscope standard en combinaison avec un logiciel d'imagerie. En outre, cette méthode est adaptée pour l'imagerie de fluorescence 13 (par exemple avec des lignées cellulaires exprimant des protéines fluorescentes ou pré-marqués avec des colorants fluorescents).

Le procédé est simple à réaliser avec la seule étape critique représenté par l'addition du BMM, quand il existe un risque de perturber la position centrale de l'ellipsoïde dans le puits en forme de U. Cela peut se traduire par analyse d'image optimale, avec des sphéroïdes dans différents plans focaux. Il est donc essentiel d'ajouter le BMM soigneusement et lentement à chaque puits. Après addition BMM il est conseillé de consulter la plaquesous un microscope et si la localisation est considéré comme inacceptable, on peut y remédier par centrifugation douce. Avec l'expérience, ce qui est rarement nécessaire. Alors que cette méthode est robuste et très reproductible, la variation inter-expérimentale pourrait se produire avec différents lots de BMM. Pour éviter cela, il est conseillé d'acheter suffisamment de BMM à partir d'un seul lot pour compléter une série d'études.

Une limitation de la méthode (comme pour toutes ces essais) est la difficulté de distinguer entre l'invasion et la prolifération, qui les cellules tumorales subissent probablement au cours de la période d'essai. Bien que le temps de doublement des cellules peut être prise en compte, ou des inhibiteurs du cycle cellulaire tels que la cytochalasine D a introduit, il est difficile de contrôler ou de clairement distinguer entre ces deux aspects différents de progression tumorale, en particulier pour les cellules tumorales en croissance rapide et pour ceux qui avoir un motif d'invasion plus "large", plutôt que d'infiltration. Pour cette raisonil est suggéré que le test de croissance 3D parallèle est effectué pour évaluer les effets spécifiques de tous les agents inhibiteurs ou stimulants. Si les études de dose-réponse attention sont effectuées, il peut être possible de sélectionner les concentrations qui minimisent les effets sur la prolifération. Par exemple, nous avons montré que l'inhibiteur de HSP90 17-AAG inhibe U-87 MG 3D invasion de sphéroïde de tumeur déjà à 24 h et à des concentrations inférieures à la concentration inhibant la croissance de 50% en 3D (GI 50) 12.

D'autre part, l'importance de ce test par rapport à d'autres essais d'invasion standard (par exemple, filtres à base de dosages ou l'invasion des cellules individuelles dans des matrices 3D 1), est que les cellules tumorales envahissent la matrice environnante de la sphéroïde, qui ressemble à un " micro-tumorale "ou un" micro-métastases ", et prend donc en compte les aspects importants de la physiopathologie d'une masse tumorale. La méthode que nous présentons fournit des informations sur lacomportement collectif des cellules tumorales, au moment de quitter d'abord les sphéroïdes, et aussi séparément, lorsque les cellules simples atteindre des régions plus éloignées dans le BMM. En outre, les cellules tumorales à l'intérieur des sphéroïdes peuvent subir une hypoxie et nutritif privation qui, grâce à des changements dans l'expression génique, peut favoriser la migration et l'invasion; ces caractéristiques sont absentes dans les analyses 2D. En outre, tout cela est disponible dans un format à haut débit à travers l'utilisation des plaques à 96 puits spécifiques et les dernières technologies d'imagerie, permettant un test de 3D plus complexe pour être facilement utilisé dans la validation des cibles et de la découverte de médicaments.

La méthode que nous présentons peut accueillir d'autres applications pour traiter des aspects supplémentaires de l'invasion des cellules tumorales. En particulier, la complexité supplémentaire peut être envisagé par l'addition de cellules hôtes, telles que les fibroblastes et / ou des cellules endothéliales, dans la sphéroïde lui-même ou la matrice environnante. Cela peut également être modifié, non seulement en termes de rigidité (par l'utilisation de différents concentrations de BMM), mais aussi en termes de composition (par l'addition d'autres composants à charge spécifique sur le tissu / organe du modèle adopté des tumeurs: par exemple, la ténascine pour les cancers du cerveau et du collagène 16 de carcinome du sein 17).

Un set-up (génération de sphéroïdes et imagerie) similaire peuvent également être adaptées pour évaluer l'invasion des tissus en 3D, où sphéroïdes tumoraux sont co-cultivées avec des corps embryoïdes ressemblant à un tissu complexe 12 ou avec d'autres organites cellulaires spécifiques (par exemple, les astrocytes pour gliome 18 ou crypte cultures pour les cancers gastro-intestinaux), mais d'autres travaux sont nécessaires pour permettre l'analyse d'image automatisée.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Web address
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Corning 354234 http://www.corning.com
Keep at  4 °C to  prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Cultrex Basement Membrane Extract, PathClear Trevigen 3432-005-01 http://www.trevigen.com
Keep at  4 °C to  prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Ultra-low attachment 96-well plate Corning 7007 http://www.corning.com
EGF Miltenyi Biotec 130-093-825 http://www.miltenyibiotec.com
Add 100 µl 1% BSA (w/v) in water to 100 µg EGF. To 25 µl of this, add 4,975 µl RHB-A medium to give a 10 µg/ml working stock. Aliquot and store at -20ºC
RHB-A medium Stem Cells Inc. SCS-SF-NB-01 http://www.stemcellsinc.com
For diluting EGF
DMEM GIBCO 31966-021 http://www.lifetechnologies.com/
Warm in 37 °C waterbath before use
Fetal Bovine Serum Biosera 1001/500 http://www.biosera.com
Heat at 56 °C to inactivate complement before use
TrypLE GIBCO 12605 http://www.lifetechnologies.com/
Cell dissociation solution
Celigo cytometer Nexcelom Bioscience n/a http://www.nexcelom.com
Specialist equipment for image capture and analysis.  Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative
IX70 inverted microscope Olympus n/a http://www.olympus.co.uk/
Used with camera for manual image capture
Retiga Exi Fast 1394 digital camera Qimaging n/a http://www.qimaging.com/
Attached to microscope for manual image capture
Image-Pro Plus 7.0 Media Cybernetics n/a http://www.mediacy.com/
Software used to control camera and microscope for manual image capture
Image-Pro Analyzer 7.0 Media Cybernetics n/a http://www.mediacy.com/
Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size
Excel 2010 Microsoft n/a http://www.microsoft.com/
Scientific graphing and statistical software
Prism 6.0 GraphPad n/a http://www.graphpad.com/
Scientific graphing and statistical software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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3D Tumor SpheroidInvasion AssayCancerGlioblastomaSquamous Cell CarcinomaEGFRMatrix InvasionDrug ScreeningImage Analysis

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Citer Cet Article
Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay. J. Vis. Exp. (99), e52686, doi:10.3791/52686 (2015).
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