Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi
Summary
This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.
Abstract
The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.
Introduction
T lenfositleri adaptif bağışıklık sisteminin önemli bileşenleridir. T hücreleri, sadece doğrudan değil, efektör çeşitli mekanizmalar aracılığıyla patojenlere karşı koruyucu bir immün yanıtlara aracılık değil, aynı zamanda aktif kendini immünolojik toleransı muhafaza edilmesi ve bağışıklık sisteminin diğer hücrelerinin tepkileri yönlendirilmesi için sorumludur. Bu işlevler, bir T hücresi reseptörü (TCR) bağlanması, sitokinler ve kemokinlerin ve metabolitleri dahil olmak üzere 1, entegre sinyalleri, bir dizi içine yönlendirilir. Adaptif bağışıklık T hücre rolü tanımlayan karakteristik spesifisite sağlamaktadır Bu sinyaller arasında, TCR, özel bir önem taşır. TCR, T hücre efektör işlevi başlatmak sinyallerini temin etmek üzere bir çok özel ve hassas bir şekilde MHC (insan ortologu HLA) molekülleri (pMHC kompleksleri) tarafından sunulan lineer peptid antijen ile etkileşime girer. PMHC ligandlar ile TCR etkileşimleri biyokimyasal parametreleri T özgüllük sadece sağlarHücre aktivasyonu, aynı zamanda daha sonra T-hücresi işlevinin 2 niteliksel etkisi vardır. Bu nedenle, eğitim T hücre fonksiyon, genellikle tanımlanmış antijenik özgünlüğe sahip klonal T hücrelerinin tepkileri incelenmesi gerekir.
10 8 farklı αβTCRs 3-4 – yaklaşık 10 ila 12 αβ hücresi içeren insan T hücresi bölmesi, tahminen 10 7 içerir. Bu farklı repertuar koruyucu bağışıklık için bir T hücre yanıtını gerektirecek potansiyel patojenlerin peptidlerin geniş bir dizi tanınması için bir fırsat sunuyor. Bu antijene 5 önce bağışıklık yanıtının yokluğunda 10 -7 – kendi kendine MHC tarafından sunulan belirli bir yabancı antijene yanıt olarak T hücrelerinin frekansı 10 -4 mertebesinde olduğu tahmin edilmektedir. Naif T hücre repertuar peptid antijenleri ve sınır tepki gösteren öz-MHC tanıma yeteneğini sağlamak için timus seçimi ile şekillenmektedirkendinden peptit antijenlerine karşı ivity koruyucu bağışıklığı 2 aracılık potansiyel kullanımını maksimize edilmesidir. Bu ihlali reaktifliği, göreceli olarak büyük bir frekans, 10 -3 tasarlanmış Bununla birlikte, – İmmünolojik olarak naif bulunan bireylerden alınan T hücrelerinin, 10 -4, yabancı MHC moleküllerini hem de onlar mevcut endojen peptidler hem de göz önünde bulundurarak, farklı genetik yapıdaki hücreler ile uyarılmaya yanıt 6. Allojenik pMHC ligandların tanınması, bireysel MHC tarafından sunulan yabancı antigenlerin tanınmasına yapısal olarak benzer olduğu; TCR, allojenik MHC molekülü hem de sunulan peptit 7 her iki kritik biyokimyasal etkileşimleri yapar. PMHC çeşitliliğine allojeneik stimülasyonu sonucunda T hücrelerinin yanıtı sağlam yapısı farklı genetik yapıdaki hücreler, 8 yüzeyi üzerinde mevcut olan kompleksler. Bu, her bir MHC yaklaşık 2 x 10 4 farklı endojen peptit antijenlerini 9 sunulur olduğu tahmin edilmektedir. Bu bAllojenik stimülasyona yanıt readth T hücre alo-tepkiselliği sonuçlanan, host hastalığı (GVHD) alograft reddi veya doku yaması gibi klinik olarak ilgili patolojisi arasında önemli bir yönüdür.
Insan T hücresi alloreaktif yanıtlarının Çalışma, geleneksel olarak allojenik hücreleri ile stimüle edilmesini müteakkip bir hassas T hücreleri poliklonal tepkilerin test üzerine yaslanmaktadır. Sınırlayıcı seyreltme ile birlikte aynı allojeneik hücre hattı ile tekrarlı uyarım allojenik HLA 10 tanımlanan tanınması klonal T hücrelerinin üretme yeteneğine sahiptir analiz eder. Endojen pMHC en büyük ve farklı bir repertuar HLA T-hücrelerinin geniş bir repertuar uyaran belirli bir alogeneik kapsamayabilir kompleksleri Ancak, bu yaklaşım tek tek allojenik pMHC ligandlarına yanıtları incelenmesi için sorunludur. Bu toplu popülasyon uyarılması ve sınırlayıcı seyreltme yaklaşım arzu edilen Reacti T hücreleri izole etmek için klonların çok sayıda tarama gerektirecektirTek pMHC bağına karşı vite. Buna ek olarak, tek bir allojenik pMHC liganda yanıt T hücrelerinin frekansı, belirli bir antijene tepki veren, insan T hücresi klonlarının verimli üretimi için bir engel sunulur naif T hücresi popülasyonları arasında nispeten düşüktür.
Tanımlama ve poliklonal popülasyonlarından antijen-spesifik T hücrelerinin elde edilmesi fluoroforla işaretlenmiş pMHC multimerlerinin 11 geliştirilmesi ile sağlanmıştır. Bu yaklaşım, bir streptavidin-işaretli flüorofor bağlanarak etiketli rekombinant çözünür biyotinile MHC molekülleri, yüklenen özel peptit antijenlerini kullanmaktadır. PMHC bir multimerizasyon çözünür pMHC ligandlar için TCR'nin bünyesinde düşük bir düzeyde (uM) bir afinite telafi avidite artırır. Etiketlenmiş hücreler tanımlanır ve akış sitometrisi ile izole edilebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, halen tipik olarak naif T hücresi popülasyonları arasında, antijen-spesifik T hücrelerin, en düşük frekans ile sınırlıdırEn akış sitometrelerinde doğru tanımlama ve tayin sınırından daha az büyüklükte siparişleri. Bu sınırlama gidermek için, tetramer-etiketli hücreler için pMHC tetramer etiketleme ve daha sonra manyetik boncuk zenginleştirmek için bir yöntem, 12 geliştirilmiştir. Bu yöntem, güvenli bir tespit numaralandırma ve düşük frekanslı antijen-spesifik T hücrelerinin elde edilmesi göstermiştir.
Bu protokol, spesifik olarak bireysel allojenik pMHC-ligantlarına tepki veren, insan T hücresi klonlarının oluşturulması için etkili bir protokolü tarif eder. Bu protokol, tek kriteri hücrelerinden T hücresi klonlarının üretimini (etkinleştirmeniz sıralama hücre bağlanımını akış sitometrisiyle ve insan T hücrelerinin in vitro kültürü için güçlü bir yöntemle Alloantijen özgü insan T hücrelerinin izolasyonu için multimer, etiketleme ve zenginleştirme pMHC (HLA) 'nin uygulandığı Şekil 1'de genel bakış).
Protocol
Representative Results
Discussion
T cell alloreactivity is a long-studied and clinically-relevant phenomenon. The robust proliferative and effector responses of T cells to allogeneic stimulation has enabled extensive analyses of human T cell responses in vitro through relatively straightforward mixed lymphocyte reactions of peripheral blood T cells against inactivated allogeneic cells. However, these primary alloreactive T cell responses are oligoclonal, comprised of a large number of individual T cells responding to specific alloantigens. This …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author would like to thank the NIH Tetramer Core Facility for tetramer production. The author would also like to thank E.D. O’Connor and K.E. Marquez at the UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility flow cytometry laboratory for assistance in cell sorting. This work was funded by National Institutes of Health grant K08AI085039 (G.P.M.).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm | Becton, Dickenson and Company | 366480 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 7801 | |
| Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 15061 | |
| Dulbecco's PBS, 1x without Ca or Mg | Corning | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| Fluorophore-labeled pMHC tetramer | NIH Tetramer Facility | NA | |
| EasySep Biotin Selection Kit | Stemcell Technologies | 18553 | |
| EasySep Selection magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| TruStain FcX Human Fc blocking solution | Biolegend | 422301 | |
| Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2) | Biolegend | 300621 | |
| Anti-CD14 FITC (clone HCD14) | Biolegend | 325603 | |
| Anti-CD19 FITC (clone HIB19) | Biolegend | 302205 | |
| Iscove's DMEM, without b-ME or L-glutamine | Corning | 15-016-CV | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| b-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Gentamicin sulfate (50 mg/ml) | Omega Scientific | GT-50 | |
| Human AB serum, male donor | Omega Scientific | HS-30 | |
| Recombinant human IL-2 | Peprotech | AF 200-02 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11131D | |
| Media | |||
| Cell sorting buffer | |||
| PBS, pH 7.4 | 1 L | ||
| BSA | 10g | ||
| EDTA (0.5 M) | 2 ml | ||
| Human T Cell Culture Medium | |||
| Iscove's DMEM | 351.6 ml | ||
| Heat-inactivated human AB serum | 40 ml | ||
| HEPES (1 M) | 4 ml | ||
| Glutamax (100 x) | 4 ml | ||
| Gentamicin (50 mg/ml) | 0.4 ml | ||
| b-mercaptoethanol (14.3 M) | 1.4 ml | ||
| Recombinant human IL-2 (1 mg/ml) | 1 ml |
References
- Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).
- Morris, G. P., Allen, P. M. How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens. Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).
- Arstilla, T. P., et al. A direct estimation of the human αβ T cell receptor diversity. Science. 286 (5441), 958-961 (1999).
- Robbins, H. S., et al. Comprehensive assessment of T-cell receptor β-chain diversity in αβ T cells. Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).
- Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).
- Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
- Felix, N. J., Allen, P. M. Specificity of T-cell alloreactivity. Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).
- Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).
- Suri, A., et al. In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket. J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).
- Yssl, H., Spits, H. Generation and maintenance of cloned human T cell lines. Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Moon, J. J., et al. Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
- Chicz, R. M., et al. Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles. J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).
- Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires. J. Immunol. In press, (2014).
- Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease. Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).
- Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).
- Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).
