Genereren van menselijke allogeen-specifieke T-cellen uit perifeer bloed

T-lymfocyten zijn kritische componenten van het adaptieve immuunsysteem. T-cellen zijn verantwoordelijk voor niet alleen direct bemiddelen beschermende immuunresponsen tegen pathogenen via verschillende effector mechanismen, maar ook actief handhaven immunologische zelftolerantie en richten van de reacties van andere cellen in het immuunsysteem. Deze functies worden doorheen een aantal geïntegreerde signalen, waaronder T-cel receptor (TCR) ligatie, cytokines en chemokines en metabolieten ^1. Van deze signalen, het TCR is van bijzonder belang, omdat de kenmerkende specificiteit die rol van de T cel definieert adaptieve immuniteit. Een TCR interactie met lineaire peptide antigenen door MHC (HLA humane ortholoog) moleculen (pMHC complexen) dat in een zeer specifieke en gevoelige wijze de signalen die T cel effectorfunctie initiëren. De biochemische parameters van TCR interactie met pMHC liganden niet alleen de specificiteit voor Tcel activatie, maar ook een kwalitatieve invloed op daaropvolgende T-celfunctie ^2. Aldus bestuderen T-celfunctie vereist vaak behandeling de reacties van klonale T-cellen met gedefinieerde antigene specificiteit.

De humane T-cel compartiment, die ongeveer 10 ¹² αβ T-cellen bevat naar schatting ¹⁰ juli ^– 10 augustus afzonderlijke αβTCRs ^3-4. Dit divers repertoire biedt gelegenheid voor de erkenning van de enorme serie van peptiden uit potentiële ziekteverwekkers die een T-cel respons voor beschermende immuniteit zouden vereisen. Geschat wordt dat de frequentie van T-cellen reageren op een bepaald vreemd antigeen door zelf-MHC in de orde van 10 ^-4 – 10 ^-7 bij ontstentenis van voorafgaande immuunrespons tegen dat antigeen ^5. De naïeve T-cel repertoire wordt gevormd door thymus selectie die zichzelf herkennen MHC-peptide-antigenen presenteren en beperken reageren verzekerentiviteit tegen zelf-peptide-antigenen, het maximaliseren van het potentieel nut voor het bemiddelen van beschermende immuniteit ^2. In strijd met deze ontworpen reactiviteit, een relatief grote frequentie, 10 ^-3 – 10 ^-4, van T-cellen uit immunologisch naïeve individuen reageren op stimulatie met allogene cellen, en zowel het vreemde MHC-moleculen en de endogene peptiden zij opleveren ^6. De erkenning van allogene pMHC liganden is structureel vergelijkbaar met de erkenning van buitenlandse antigenen gepresenteerd door zelf-MHC; de TCR maakt kritische biochemische interacties met zowel allogene MHC-molecuul en het gepresenteerde peptide ^7. De robuuste karakter van de respons van T-cellen allogene stimulatie gevolg van de diversiteit van pMHC complexen aanwezig op het oppervlak van allogene cellen ^8. Geschat wordt dat elk MHC geeft ongeveer 2 x 10 ⁴ verschillende endogene peptide antigenen ^9. Deze breadth respons op allogene stimulatie is een belangrijk aspect van de klinisch relevante pathologie, zoals transplantaatafstoting of graft versus host disease (GVHD) als gevolg van T cel alloreactiviteit.

Studie van humane T cel responsen alloreactieve traditioneel vertrouwd op behandeling polyklonale responsen van naïeve T-cellen na stimulatie met allogene cellen. Herhaalde stimulatie met dezelfde allogene cellijn gecombineerd met beperkende verdunning analyses kan genereren klonale T-cellen met gedefinieerde erkenning van allogene HLA ^10. Deze benadering is problematisch voor de behandeling reacties op individuele allogene pMHC liganden, zoals de grote en diverse repertoire van endogene pMHC complexen voor een bepaalde allogene HLA onderhavige stimuleert een breed repertoire van T-cellen. Deze massapopulatie stimulatie en beperkende verdunning aanpak screening van grote aantallen klonen vereisen om T-cellen te isoleren met de gewenste Reactivity tegen een enkele pMHC ligand. Bovendien is de frequentie van T-cellen reageren op een individuele allogene pMHC ligand relatief laag bij naïeve T-cel populaties die een belemmering voor efficiënte productie van humane T cel klonen die reageren op een bepaald antigeen presenteert.

Identificatie en isolatie van antigeen-specifieke T-cellen van polyklonale populaties zijn ingeschakeld door de ontwikkeling van fluorofoor gelabeld pMHC multimeren ^11. Deze benadering maakt gebruik van specifiek peptide antigenen in recombinante oplosbare gebiotinyleerde MHC moleculen die gelabeld door binding aan een met streptavidine gemerkt fluorofoor geladen. Multimerizatie van pMHC verhoogt de gretigheid, het compenseren van de intrinsiek lage (uM) affiniteit van TCR voor oplosbare pMHC liganden. Gelabelde cellen kunnen worden geïdentificeerd en geïsoleerd door flowcytometrie. Echter, deze benadering nog steeds beperkt door de lage frequentie van antigeen-specifieke T-cellen bij naïeve T-celpopulaties, die typischordes van grootte kleiner dan de limiet van nauwkeurige identificatie en kwantificatie van de meeste flowcytometers. Om deze beperking te pakken, is een werkwijze pMHC tetrameer labeling en daaropvolgende magnetische bead verrijking voor tetrameer gelabelde cellen ¹² ontwikkeld. Deze methode betrouwbare detectie, telling en isolatie van laagfrequente antigeen-specifieke T-cellen aangetoond.

Dit protocol beschrijft een effectief protocol voor het genereren van humane T cel klonen die specifiek reageren op afzonderlijke allogene pMHC liganden. Het protocol geldt pMHC (HLA) multimeer etikettering en verrijking voor de isolatie van allogeen-specifieke menselijke T-cellen met flowcytometrie celsortering en een robuuste werkwijze voor in vitro kweek van humane T-cellen om de productie van T-celklonen uit één gesorteerde cellen (inschakelen overzicht in figuur 1).