Summary

Generazione di Human alloantigene-specifiche cellule T da sangue periferico

Published: November 21, 2014
doi:

Summary

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Abstract

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

Introduction

I linfociti T sono componenti critici del sistema immunitario adattativo. Le cellule T sono responsabili non solo mediare direttamente risposte immunitarie protettive a patogeni attraverso una varietà di meccanismi effettori, ma anche mantenere attivamente immunologica auto-tolleranza e dirigere le risposte di altre cellule del sistema immunitario. Queste funzioni sono diretti attraverso una serie di segnali integrati, compreso recettore delle cellule T (TCR) legatura, citochine e chemochine, e metaboliti 1. Di questi segnali, il TCR è di particolare importanza, in quanto fornisce la specificità caratteristica che definisce il ruolo delle cellule T nell'immunità adattativa. Un TCR interagisce con antigeni peptidici lineari presentati da MHC (HLA ortologo umano) molecole (complessi pMHC) in modo altamente specifico e sensibile per fornire i segnali che attivano la funzione delle cellule T effettrici. I parametri biochimici delle interazioni TCR con leganti pMHC non solo forniscono la specificità per Tattivazione delle cellule, ma anche avere un impatto qualitativo sulla funzione delle cellule T 2 successiva. Così, studiando la funzione delle cellule T richiede spesso di esaminare le risposte delle cellule T clonali con specificità antigenica definito.

Il vano umano delle cellule T, che contiene circa 10 12 cellule T αβ, contiene, secondo le stime 10 luglio-10 agosto αβTCRs distinte 3-4. Questo vasto repertorio offre opportunità per il riconoscimento della vasta gamma di peptidi da potenziali agenti patogeni tali da richiedere una risposta delle cellule T per l'immunità protettiva. Si stima che la frequenza delle cellule T rispondere ad un dato antigene estraneo presentata dalla auto-MHC è dell'ordine di 10 -4 – 10 -7 in assenza di prima risposta immunitaria a questo antigene 5. L'ingenuo repertorio delle cellule T è modellato dalla selezione timica per garantire la capacità di riconoscere auto-MHC presentano antigeni peptidici e limite reagisconoivity contro antigeni self-peptide, massimizzando l'utilità potenziale di mediare l'immunità protettiva 2. Tuttavia, in violazione del presente progettato reattività relativamente grande frequenza, 10 -3 – 10 -4, di cellule T da individui immunologicamente naive rispondere alla stimolazione con cellule allogeniche, riconoscendo entrambe le molecole MHC estere nonché peptidi endogeni che presentano 6. Il riconoscimento di allogenici ligandi pMHC è strutturalmente simile al riconoscimento di antigeni estranei presentate da auto-MHC; TCR rende interazioni biochimiche critici sia con la molecola MHC allogeniche e il peptide presentato 7. La natura robusta della risposta delle cellule T allogeniche ai risultati della stimolazione della diversità dei pMHC complessi presenti sulla superficie delle cellule allogeniche 8. Si stima che ogni MHC presenta circa 2 x 10 4 differenti antigeni peptidici endogeni 9. Questo breadth di risposta alla stimolazione allogenico è un aspetto significativo della patologia clinicamente rilevanti, come il rigetto o di malattia da trapianto contro ospite (GVHD), derivanti da alloreattività cellule T.

Studio delle cellule T risposte alloreattivi umani ha tradizionalmente invocato l'esame delle risposte policlonali di cellule T naive in seguito alla stimolazione con cellule allogeniche. Stimolazione ripetuta con la stessa linea di cellule allogeniche combinato con diluizione limite analisi è in grado di generare cellule T clonali con riconoscimento definito di allogenico HLA 10. Tuttavia, questo approccio è problematico per l'esame delle risposte ai singoli ligandi allogenici pMHC, come il grande e variegato repertorio di endogena pMHC complessi presenti per un determinato allogenico HLA stimola un ampio repertorio di cellule T. Questa stimolazione popolazione di massa e di limitare la diluizione approccio richiederebbe lo screening di un gran numero di cloni per isolare le cellule T con il riatti desideratovità contro un singolo ligando pMHC. Inoltre, la frequenza delle cellule T che rispondono ad un individuo allogenico pMHC ligando è relativamente bassa tra popolazioni di cellule T naive, che presenta una barriera efficace generazione di cloni di cellule T umane sensibili ad un dato antigene.

Identificazione e isolamento di cellule T antigene-specifiche da popolazioni policlonali sono stati abilitati dallo sviluppo di fluoroforo marcata pMHC multimeri 11. Questo approccio utilizza specifici antigeni peptidici caricati in molecole MHC ricombinanti solubili biotinilate, etichettati legandosi ad un fluoroforo streptavidina marcata. Multimerizzazione di pMHC aumenta l'avidità, compensando la intrinsecamente basso (mM) affinità del TCR per ligandi solubili pMHC. Cellule marcate possono essere identificati e isolati mediante citometria a flusso. Tuttavia, questo approccio è ancora limitata dalla bassa frequenza di cellule T antigene-specifiche tra naive popolazioni di cellule T, che sono tipicamenteordini di grandezza inferiore al limite di identificazione accurata e quantificazione sulla maggior citofluorimetri. Per affrontare questa limitazione, un metodo di etichettatura tetramero pMHC e successiva tallone arricchimento magnetico per cellule tetramero-marcato è stato sviluppato 12. Questo metodo ha dimostrato rilevamento affidabile, l'enumerazione, e l'isolamento di cellule T antigene-specifiche bassa frequenza.

Questo protocollo descrive un protocollo efficace per la generazione di cloni di cellule T umane che rispondono specificamente ai singoli ligandi allogenici pMHC. Il protocollo si applica pMHC (HLA) etichettatura Multimer e di arricchimento per l'isolamento di cellule T umane specifiche per alloantigene con citometria a flusso delle cellule di ordinamento e un metodo robusto per la coltura in vitro di cellule T umane per consentire la produzione di cloni di cellule T da cellule ordinati singole ( panoramica nella Figura 1).

Protocol

NOTA: Questo protocollo richiede l'utilizzo di campioni di sangue periferico di volontari umani. Tutta la ricerca con soggetti umani deve essere esaminato e approvato da un studi sull'uomo Institutional Review Board per garantire la conformità con la Dichiarazione di Helsinki (2013) e l'Health Insurance Portability e Accountability Act del 1996. 1. Isolamento dei linfociti T da sangue intero Prima di iniziare, riscaldare il mezzo gradiente di densità a temperatura am…

Representative Results

Questo protocollo descrive la generazione di colture di cellule T clonale umani con definito alloantigene specificità attraverso un arricchimento tallone magnetico e flusso a cella singola citometria di ordinamento strategia. La Figura 1 fornisce una panoramica del processo. Figura 1: Panoramica del protocollo Il protocollo qui descritto forn…

Discussion

T cell alloreactivity is a long-studied and clinically-relevant phenomenon. The robust proliferative and effector responses of T cells to allogeneic stimulation has enabled extensive analyses of human T cell responses in vitro through relatively straightforward mixed lymphocyte reactions of peripheral blood T cells against inactivated allogeneic cells. However, these primary alloreactive T cell responses are oligoclonal, comprised of a large number of individual T cells responding to specific alloantigens. This …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The author would like to thank the NIH Tetramer Core Facility for tetramer production. The author would also like to thank E.D. O’Connor and K.E. Marquez at the UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility flow cytometry laboratory for assistance in cell sorting. This work was funded by National Institutes of Health grant K08AI085039 (G.P.M.).

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm Becton, Dickenson and Company 366480
Lymphoprep Stemcell Technologies 7801
Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit Stemcell Technologies 15061
Dulbecco's PBS, 1x without Ca or Mg Corning 21-031-CV
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
EDTA Sigma-Aldrich E6635
Fluorophore-labeled pMHC tetramer NIH Tetramer Facility NA
EasySep Biotin Selection Kit Stemcell Technologies 18553
EasySep Selection magnet Stemcell Technologies 18000
TruStain FcX Human Fc blocking solution Biolegend 422301
Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2) Biolegend 300621
Anti-CD14 FITC (clone HCD14) Biolegend 325603
Anti-CD19 FITC (clone HIB19) Biolegend 302205
Iscove's DMEM, without b-ME or L-glutamine Corning 15-016-CV
HEPES Corning 25-060-CI
b-Mercaptoethanol  Life Technologies 21985-023
Glutamax Life Technologies 35050061
Gentamicin sulfate (50 mg/ml) Omega Scientific GT-50
Human AB serum, male donor Omega Scientific HS-30
Recombinant human IL-2 Peprotech AF 200-02
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 Life Technologies 11131D
Media
Cell sorting buffer
PBS, pH 7.4 1 L
BSA 10g
EDTA (0.5 M) 2 ml
Human T Cell Culture Medium
Iscove's DMEM 351.6 ml
Heat-inactivated human AB serum 40 ml
HEPES (1 M) 4 ml
Glutamax (100 x) 4 ml
Gentamicin (50 mg/ml) 0.4 ml
b-mercaptoethanol (14.3 M) 1.4 ml
Recombinant human IL-2 (1 mg/ml) 1 ml

References

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Citer Cet Article
Jama, B. P., Morris, G. P. Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (93), e52257, doi:10.3791/52257 (2014).

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