Imágenes en tiempo real de Axonal Transporte de Quantum Dot-etiquetado BDNF en las neuronas primarias

Las neuronas son células altamente cuyos procesos de largo ya menudo muy elaborado, son fundamentales para el establecimiento y mantenimiento de la estructura y función de los circuitos neuronales polarizados. El axón juega un papel vital en el que transporten cargas desde y hacia las sinapsis. Las proteínas y orgánulos sintetizados en el soma celular necesitan ser transportados a través de los axones para llegar a la terminal presináptica para apoyar la función neuronal. Correspondientemente, señales recibidas en los axones distales necesitan ser transducidas y se transportan a la soma. Estos procesos son esenciales para la supervivencia neuronal, diferenciación y mantenimiento. En que el transporte axonal en algunas neuronas debe llevarse a cabo a través de distancias más de 1000 veces el diámetro del cuerpo celular, la posibilidad se prevé fácilmente que incluso pequeños déficits podrían afectar notablemente la función neuronal y el circuito.

Brain-factor neurotrófico derivado (BDNF), un miembro de la familia de las neurotrofinas de factores de crecimiento, está presente en maregiones del cerebro ny, incluyendo el hipocampo, corteza cerebral, y el cerebro anterior basal. BDNF juega un papel crucial en la formación de la cognición y la memoria mediante el apoyo a la supervivencia, diferenciación y función de las neuronas que participan en circuitos cognitivos. BDNF se une a su receptor, el TrkB tirosina quinasa, en el axón terminal donde activa vías de señalización mediada por TrkB, incluyendo la proteína quinasa activada por mitógeno / regulada por señal extracelular de la proteína quinasa (MAPK / ERK), fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) y la fosfolipasa C-gamma (PLCγ). Las proteínas que participan en estas vías de señalización están empaquetados en estructuras vesiculares endocítica para formar el BDNF / TrkB señalización endosoma ^1-6 que luego son retrógradamente transportado al soma neuronal.

La cámara de cultivo de microfluidos es una plataforma muy útil para estudiar la biología axonal en condiciones normales, así como en el ajuste de la lesión y la enfermedad ^7,8. Por axones de aislamientoa partir de los cuerpos celulares, el dispositivo ha permitido uno para estudiar el transporte específicamente en los axones ^8-10. Las plataformas de microfluidos PDMS base con 450 micras barreras microsurco utilizados en este estudio fueron adquiridos comercialmente (ver Tabla de Materiales). Para examinar el transporte BDNF, hemos desarrollado una nueva tecnología para producir BDNF monobiotinylated (mBtBDNF). Aprovechamos el péptido aceptor de biotina, AP (también conocido como AviTag). Es una secuencia de 15 aminoácidos que contiene un residuo de lisina que puede ligarse específicamente a una biotina por la enzima ligasa de biotina coli Escherichia, BirA. Hemos fusionado el AviTag a la C-terminal de la pre-ratón proBDNF ADNc mediante PCR (Figura 1A). La construcción se clonó en el vector de expresión de mamífero, pcDNA3.1-myc su vector. También clonado el ADN bacteriana BirA en el pcDNA3.1-myc su vector. Los dos plásmidos se co-transfectaron transitoriamente en células HEK293FT para expresar ambas proteínas. BirA catalizó la ligadura de Bioten concreto a la lisina residen dentro del AviTag en el C-terminal de BDNF en una proporción de 1: 1 para producir monómero monobiotinylated BDNF. Biotinilado, BDNF maduro con una masa molecular de ~ 18 kDa fue recuperado y purificado a partir de los medios de comunicación utilizando resina de Ni-(Figura 1C). La biotinilación de BDNF era completa, como se juzga por la incapacidad de detectar sin modificar BDNF por inmunotransferencia (Figura 1D). Puntos cuánticos conjugados con estreptavidina, QD 655, se utilizan para etiquetar mBtBDNF hacer QD-BDNF. La presencia de la AviTag no interfiera con la actividad del BDNF como la mBtBDNF fue capaz de activar TrkB fosforilado (Figura 1E) y estimular el crecimiento de neuritas (Figura 1F) en la medida de BDNF humano recombinante (rhBDNF). Inmunotinción demostró que QD-BDNF colocalized con TrkB en los axones del hipocampo, lo que indica que QD-BDNF es bioactivo (Figura 1G). Para estudiar el transporte BDNF, QD-BDNF fue añadido al compartimento de axón distalculturas de microfluidos que contienen rata E18 neuronas del hipocampo (Figura 2A). QD-BDNF transporte retrógrado dentro de los axones fue capturado por el tiempo real de imágenes en vivo de la etiqueta fluorescente de color rojo (con soporte para vídeos S1, S2). Mediante el análisis de la quimógrafo generado, QD-BDNF se observó para ser transportado retrógradamente a una velocidad de movimiento de alrededor de 1,06 m / seg (Figura 3A). GFP o marcado con mCherry BDNF se han utilizado para seguir el movimiento axonal de BDNF. Los principales inconvenientes son que no son lo suficientemente brillantes para los estudios de una sola molécula. Además, la presencia de tanto anterógrada y retrógrada movimientos de BDNF hace que sea difícil evaluar si o no el BDNF retrógradamente transportado estaba en un complejo neurotrofina / receptor.

En este video, nos demuestran las técnicas que se utilizan para examinar el tráfico directo de QD-BDNF en las cámaras de microfluidos que utilizan las neuronas primarias. El ultrabrightness y excelente fotoestabilidad de los puntos cuánticos MAKes posible realizar el seguimiento a largo plazo del transporte BDNF. Estas técnicas pueden ser explotados para mejorar estudios de la función axonal en AD, HD, y otros trastornos neurodegenerativos.