初级量子神经元轴突运输的实时成像点标记的BDNF

神经元是高度分化的细胞，其长，通常高度阐述的过程是基本建立和保持神经回路的结构和功能。轴突起着运载的货物和从突触至关重要的作用。蛋白质和细胞器的细胞胞体合成需要通过轴突运输到达突触前末梢，支持神经元功能。相应地，接收的信号在远端轴突需要被转并输送到体细胞。这些方法可用于神经元的存活，分化和维持所必需的。在某些神经元的轴突运输必须通过的距离超过1000倍的细胞体的直径进行，有可能容易地预想到，即使是很小的缺陷可显着影响神经元和电路功能。

脑源性神经营养因子（BDNF），生长因子的神经营养因子家族中的一员，是目前在马纽约州的大脑区域，包括海马，大脑皮层和基底前脑。 BDNF起着认知和记忆的形成所配套的存活，分化，并参与认知神经回路的功能至关重要的作用。 BDNF结合到其受体的酪氨酸激酶受体TrkB，在轴突终端那里它激活的TrkB介导的信号传导途径，包括有丝分裂原激活的蛋白激酶/细胞外信号调节蛋白激酶（MAPK / ERK），磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）和磷脂酶C-γ（PLCγ）。在参与这些信号传导途径的蛋白被包装到内吞囊泡结构，以形成BDNF / TrkB的信令内体^1-6被再逆行转运到神经元胞体。

微流体培养室是研究在正常条件下，以及在损伤和疾病^7,8的设定轴突生物学一个非常有用的平台。通过隔离轴突从细胞体，该装置允许一个具体研究运输中的轴突^8-10。在与在该研究中使用450微米的微沟槽屏障基于PDMS的微流体平台进行商业购买（参见材料表）。为了研究BDNF的运输，我们开发了一种新的技术，生产monobiotinylated BDNF（mBtBDNF）。我们把生物素受体肽，美联社（又称重组蛋白质）的优势。它是一个包含一个赖氨酸残基，可以由大肠杆菌酶的生物素连接酶，BirA的具体连接到生物素15的氨基酸序列。我们融合的重组蛋白质的小鼠预先proBDNF基因的C末端，通过PCR（ 图1A）。该构建体被克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1 myc基因-His载体。我们还克隆的细菌BirA的DNA导入的pcDNA3.1 myc基因-His载体。两个质粒瞬时共转染到HEK293FT细胞表达两种蛋白。 BirA的催化毕结扎在具体的赖氨酸驻留在重组蛋白质中的BDNF的在1的C末端：1的比例以产生monobiotinylated BDNF单体。生物素化的，成熟的BDNF与〜18kDa的分子质量，回收和使用的Ni-树脂（ 图1C）的介质纯化。 BDNF的生物素化是完全的，作为判断无法通过免疫印迹法（ 图1D），以检测未修饰BDNF。链霉亲和共轭量子点，量子点655，分别用来标明mBtBDNF使QD-BDNF。的重组蛋白质的存在下不与BDNF的活性干扰作为mBtBDNF能够激活磷酸化的TrkB（ 图1E）和刺激神经 ​​突向外生长（ 图1F），以重组人BDNF（rhBDNF）的程度。免疫组化显示，QD-BDNF共定位与TrkB的海马神经轴突，表明QD-BDNF的生物活性（ 图1G）。研究了BDNF的运输，QD-BDNF加入到远端轴突隔室含E18大鼠海马神经元（ 图2A）微流控文化。在轴突QD-BDNF逆行运输被抓获的红色荧光标记（ 支持视频S1，S2）的实时现场图像。通过分析所产生的kymograph，QD-BDNF的观察可以在约1.06微米/秒（ 图3A）的移动速度逆向转移。 GFP或mCherry-标记的BDNF已被用于跟踪BDNF的神经轴突的运动。主要的缺点是，他们不是为单个分子的研究不够明亮。另外，无论是顺行性与逆行BDNF运动的存在使得难以评估的逆向转移BDNF是否是一种神经营养蛋白/受体复合体。

在这段视频中，我们展示了用于检查QD-BDNF在利用原代神经元的微流控室现场贩卖的技术。该ultrabrightness和量子点麦出色的耐光性ES能够进行BDNF传输的长期跟踪。这些技术可被利用来提高AD中，HD和其他神经变性疾病的轴突功能的研究。