Real-time beeldvorming van Axonale Vervoer van Quantum Dot-label BDNF in primaire neuronen

Neuronen zijn sterk gepolariseerde cellen waarvan de lange en vaak zeer uitgewerkte processen zijn essentieel voor het opzetten en onderhouden van de structuur en functie van neurale circuits. Het axon speelt een vitale rol bij het uitvoeren vracht naar en van synapsen. Eiwitten en organellen gesynthetiseerd cel soma moeten worden getransporteerd door axonen in de presynaptische terminal bereikt neuronale functie ondersteunen. Dienovereenkomstig ontvangen signalen bij het distale axons moeten worden getransduceerd en overgebracht naar de soma. Deze processen zijn essentieel voor neuronale overleving, differentiatie en onderhoud. In dat axonaal transport in sommige neuronen worden uitgevoerd door middel afstanden meer dan 1000 maal de diameter van het cellichaam, is de mogelijkheid gemakkelijk beoogd dat zelfs kleine tekorten aanzienlijk kunnen beïnvloeden neuronale en circuitfunctie.

Hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF), een lid van de neurotrofine familie van groeifactoren, aanwezig in ma isny gebieden van de hersenen, inclusief de hippocampus, cerebrale cortex en basale voorhersenen. BDNF speelt een cruciale rol in cognitie en geheugenvorming door ondersteuning van de overleving, differentiatie en functie van neuronen die deelnemen aan cognitieve circuits. BDNF bindt aan zijn receptor, het tyrosine kinase TrkB bij het axon terminal waar activeert TrkB-gemedieerde signaalwegen inclusief mitogeen geactiveerde proteïne kinase / extracellulair signaalgereguleerde proteïne kinase (MAPK / ERK), fosfatidylinositol-3-kinase (PI3K) en fosfolipase C-gamma (PLCy). De eiwitten die deelnemen aan deze signaalroutes verpakt op endocytische vesiculaire structuren om de BDNF / TrkB signalering endosoom ^1-6 die vervolgens retrograde getransporteerd naar de neuronale soma vormen.

De microfluïdische cultuur kamer is een zeer nuttig platform voor het bestuderen van axonale biologie onder normale omstandigheden als in de setting van letsel en ziekte ^7,8. Door het isoleren van axonenuit de cel lichamen, heeft het apparaat mag een tot vervoer specifiek bestuderen in axonen ^8-10. De PDMS microfluïdische gebaseerde platforms met 450 urn microgroove belemmeringen die in deze studie werden commercieel aangeschaft (zie Materialen tabel). Om BDNF vervoer te onderzoeken, ontwikkelden we een nieuwe technologie om monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) produceren. We hebben geprofiteerd van de biotine acceptor peptide, AP (ook bekend als AviTag). Het is een 15 aminozuursequentie die een lysine-residu die specifiek een biotine kan worden geligeerd door het Escherichia coli enzym biotine ligase, BirA bevat. We gefuseerd de AviTag de C-terminus van het muis vooraf proBDNF cDNA door PCR (Figuur 1A). Het construct werd gekloneerd in de zoogdier expressievector pcDNA3.1 myc-vector zijn. We gekloneerd ook BirA bacterieel DNA in de pcDNA3.1 myc-vector zijn. De twee plasmiden werden transiënt gecotransfecteerd in HEK293FT cellen beide eiwitten tot expressie. BirA gekatalyseerde de ligatie van biotin het bijzonder de lysine in de AviTag bevinden bij de C-terminus van BDNF bij een 1: 1 verhouding produceren monobiotinylated BDNF monomeer. Gebiotinyleerde, volwassen BDNF met een molecuulgewicht van ~ 18 kDa werd teruggewonnen en gezuiverd van media met Ni-hars (figuur 1C). De biotinylering van BDNF was voltooid, zoals beoordeeld door het onvermogen om ongemodificeerde BDNF detecteren door immunoblotting (figuur 1D). Streptavidine geconjugeerde quantum dots, QD 655, werden gebruikt om mBtBDNF labelen naar QD-BDNF maken. De aanwezigheid van de AviTag niet interfereert met de activiteit van BDNF als het mBtBDNF kon gefosforyleerd TrkB (figuur 1E) activeren en stimuleren uitgroei van neurieten (figuur 1F) voor zover van recombinant humaan BDNF (rhBDNF). Immunokleuring aangetoond dat QD-BDNF colocalized met TrkB in de hippocampus axonen, wat aangeeft dat QD-BDNF is bioactieve (figuur 1G). Om het transport BDNF bestuderen, werd QD-BDNF toegevoegd aan distale axon compartiment vanmicrofluidic kweken die E18 rat hippocampale neuronen (Figuur 2A). QD-BDNF retrograde transport binnen axonen werd gevangen genomen door real-time live imaging van de rode fluorescerende tag (Ondersteunende video's S1, S2). Door het analyseren van de kymograaf gegenereerd, werd QD-BDNF waargenomen retrogradely worden vervoerd bij een bewegende snelheid van ongeveer 1,06 um / sec (Figuur 3A). GFP of mCherry-gelabeld BDNF zijn gebruikt om axonale verkeer van BDNF te volgen. De belangrijkste nadelen zijn dat ze niet helder genoeg voor single molecule studies. Ook de aanwezigheid van zowel anterograde en retrograde BDNF bewegingen maakt het moeilijk te beoordelen of de retrograde getransporteerd BDNF was een neurotrophin / receptorcomplex.

In deze video tonen we de technieken die gebruikt worden om live handel in QD-BDNF in microfluïdische kamers met zowel primaire neuronen te onderzoeken. De ultrabrightness en uitstekende fotostabiliteit van quantum dots makes het mogelijk om lange termijn volgen van BDNF transport voeren. Deze technieken kunnen worden benut om de studies van axonale functie te verbeteren in AD, HD, en andere neurodegeneratieve aandoeningen.