Visualizzazione delle risposte tossina batterica provocata con diretta microscopia a fluorescenza cellulare

Tossine batteriche legano al colesterolo nelle membrane, formando pori che permettono la fuoriuscita di contenuto cellulare e afflusso di materiali dall'ambiente esterno. La cella può recuperare da questo insulto, che richiede processi di riparazione membrane attive, oppure muoiono a seconda della quantità di esposizione tossina e tipo cellulare ^1. Inoltre, queste tossine indurre forti risposte infiammatorie in host infetti attraverso l'attivazione di cellule immunitarie, compresi i macrofagi, che producono una matrice di citochine pro-infiammatorie ^2. Molti batteri Gram-positivi producono colesterolo vincolante tossine che hanno dimostrato di contribuire alla loro virulenza attraverso meccanismi in gran parte non ancora caratterizzati.

Alterazioni morfologiche della membrana plasmatica di cellule esposte a tali tossine includere il sequestro in colesterolo arricchiti protuberanze superficiali, che può essere versato nello spazio extracellulare, suggerendo una difesa intrinseca cellulareMeccanismo ^3,4. Questo processo si verifica in tutte le cellule in assenza di attività metabolica, e possono essere visualizzati utilizzando EM dopo ⁴ chimica fissazione. In cellule immunitarie quali macrofagi che mediano l'infiammazione in risposta all'esposizione tossina, vescicole di membrana indotte sono suggeriti per contenere citochine della famiglia IL-1 e può essere responsabile sia spargimento tossina e diffondere queste citochine pro-infiammatorie ^5,6,7. Un collegamento tra IL-1β rilascio e un tipo specifico di morte cellulare, pyroptosis chiamato è stato suggerito, in quanto entrambi sono processi caspasi-1 ⁸ dipendenti. Per risolvere la complessità di questa risposta dei macrofagi, che comprende vincolante tossina, spargimento di vescicole di membrana, rilascio di citochine, e la morte delle cellule potenzialmente, abbiamo sviluppato le tecniche di etichettatura e metodi di microscopia a fluorescenza che consentono la visualizzazione in tempo reale della tossina cellule interazioni, tra cui misurazioni di disfunzioni e morte (Figura 1). Utilizzaredi imaging cellulare dal vivo è necessario a causa di limiti di altre tecniche. Approcci biochimici non possono risolvere effetti che si verificano in cellule individuali, mentre citofluorimetria non offre alta risoluzione, visualizzazione in tempo reale delle singole celle. I metodi qui descritti possono essere applicati ad analisi cinetica delle risposte indotte da altri stimoli implicano complesse variazioni fenotipiche nelle cellule.