Visualisation des réponses toxine bactérienne induite en utilisant direct microscopie de fluorescence cellulaire

Toxines bactériennes se lier au cholestérol dans les membranes, en formant des pores qui permettent une fuite du contenu cellulaire et l'afflux de matériaux provenant de l'environnement extérieur. La cellule peut soit se remettre de cette insulte, ce qui nécessite actifs des processus de réparation des membranes, ou mourir en fonction de la quantité d'exposition aux toxines et ¹ type de cellule. En outre, ces toxines induisent de fortes réactions inflammatoires chez les hôtes infectés par l'activation des cellules immunitaires, dont les macrophages, qui produisent une gamme de cytokines pro-inflammatoires ^2. De nombreuses bactéries Gram-positives produisent des toxines cholestérol contraignants qui ont été montrés pour contribuer à leur virulence en grande partie grâce à des mécanismes non caractérisés.

Des changements morphologiques dans la membrane plasmique des cellules exposées à ces toxines comprennent leur séquestration dans les protubérances de surface cholestérol enrichis, qui peuvent être versées dans l'espace extracellulaire, ce qui suggère une défense cellulaire intrinsèqueMécanisme ^3,4. Ce processus se produit sur ​​toutes les cellules en l'absence de l'activité métabolique, et peuvent être visualisées à l'aide EM au bout de ⁴ fixation chimique. Dans les cellules immunitaires comme les macrophages, qui interviennent dans l'inflammation en réponse à l'exposition aux toxines, des vésicules membranaires induits sont suggérées pour contenir cytokines de la famille IL-1 et peut être responsable à la fois pour l'excrétion des toxines et la diffusion de ces cytokines pro-inflammatoires ^5,6,7. Un lien entre l'IL-1β libération et un type spécifique de mort cellulaire, appelée pyroptosis a été suggéré, car les deux sont des processus caspase-1 dépendantes ^8. Pour démêler les complexités de cette réponse des macrophages, ce qui inclut la liaison toxine, l'excrétion de vésicules membranaires, la libération de cytokines et la mort cellulaire potentiellement, nous avons développé des techniques d'étiquetage et les méthodes de microscopie par fluorescence qui permettent de visualiser en temps réel des toxines cellulaires des interactions, y compris mesures de dysfonctionnement et la mort (figure 1). Utiliserd'imagerie des cellules vivantes est nécessaire en raison des limitations dans d'autres techniques. Approches biochimiques ne peut pas résoudre effets qui se produisent dans des cellules individuelles, tout en cytométrie en flux n'offre pas de haute résolution, visualisation en temps réel des cellules individuelles. Les méthodes décrites ici peuvent être appliqués à l'analyse cinétique des réactions induites par des stimuli complexes impliquant d'autres changements phénotypiques dans les cellules.